董華雨,陳勝峰,吳萍,稅典章,許凡,高璐

摘要：鑒于異育銀鯽鰓出血病與溫度相關(guān)的發(fā)病特征，分別對異育銀鯽注射HSP70抑制劑和促進劑進行了其體內(nèi)熱休克蛋白的人工干預(yù)。研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖池塘自然發(fā)病的具有鰓出血病典型癥狀的異育銀鯽，其肝臟內(nèi)HSP70基因的表達量與健康異育銀鯽相比明顯升高，人工感染CyHV-2病毒后，肝臟內(nèi)HSP70表達量在24h后顯著增加，當魚體表現(xiàn)出發(fā)病癥狀時，HSP70表達量極顯著上升。對照組在人工感染CyHV-2后，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在魚體發(fā)病時顯著升高，且在發(fā)病時與注射促進劑和抑制劑組都有極顯著差異;注射HSP70促進劑組在人工感染CyHV-2后，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在12h時顯著升高。注射HSP70抑制劑的異育銀鯽體內(nèi)病毒數(shù)在感染病毒后12h時，就達到最高點，明顯高于對照組及注射促進劑組的同時間段病毒數(shù)。說明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的積極作用。

關(guān)鍵詞：異育銀鯽，熱休克蛋白，CyHV-2，谷氨酰胺，槲皮素

中圖分類號：S94 ? ?文獻標識碼：A

鰓出血病是異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）因感染鯉Ⅱ型皰疹病毒（CyHV-2）而致的一種疾病，初期病魚表現(xiàn)為食欲減退，離群獨游，后期則表現(xiàn)為鰓部出血，胸部、腹部有出血點，腹部腫脹，尾鰭、背鰭明顯發(fā)白。鰓出血病常在5月、6月、10月、11月水體溫度在15℃～25℃時爆發(fā)，當水溫高于30℃及低于15℃時都會停止發(fā)病[1]，說明魚體常可以攜帶病毒生存。因此，異育銀鯽鰓出血病的發(fā)病過程，除了從病原體（病毒）角度考慮是否是因15℃～25℃溫度適宜病毒增殖外，魚體內(nèi)自身與溫度高低相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達也可作為關(guān)注的焦點。

熱休克蛋白是生物體在應(yīng)激條件下，如饑餓、高溫、缺氧、感染等狀態(tài)下在體內(nèi)高效表達的一類蛋白質(zhì)。其中，熱休克蛋白70（HSP70）是一種細胞保護蛋白，也是主要的分子伴侶蛋白之一。HSP70還能參與免疫復(fù)合物的形成，加強抗原提呈[2]，并能在體內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答[3]。在對水生動物的研究中發(fā)現(xiàn)，凡濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的HSP70可與白斑綜合征病毒（WSSV）的結(jié)構(gòu)蛋白VP24、VP26相互作用，VP24、VP26可降低HSP70的ATPase活性[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，魚體內(nèi)HSP70在感染CyHV-2后顯著上調(diào)，說明HSP70在鰓出血病的發(fā)生中也起著一定的作用。由此可見，HSP70的研究，是一條很好地開展異育銀鯽鰓出血病發(fā)生機制研究的途徑。反之，如果通過人工干預(yù)，降低或增高魚體內(nèi)的熱休克蛋白含量，是否也會對魚體內(nèi)的病毒作用產(chǎn)生抑制或促進效應(yīng)。因此，基于這樣的設(shè)想，本文通過給魚體注射HSP70促進劑或抑制劑，然后人工感染CyHV-2，研究了魚體在人為地提高或降低體內(nèi)熱休克蛋白、并感染CyHV-2情況下的生理響應(yīng)，以期為闡明異育銀鯽鰓出血病發(fā)生機制提供有效的基礎(chǔ)資料，為異育銀鯽抗CyHV-2的藥物或飼料開發(fā)提供有力的依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

健康的異育銀鯽購自蘇州市南環(huán)批發(fā)市場，共225尾。運回實驗室后暫養(yǎng)于曝氣后的水中，經(jīng)部分抽檢，確證未感染CyHV-2病毒。發(fā)病的異育銀鯽具有典型的鰓出血病癥狀，取自江蘇大豐。病魚的內(nèi)臟取出后放于-80℃保存。斛皮素和谷氨酰胺分別購自上海士鋒生物科技有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?異育銀鯽CyHV-2的人工感染

將異育銀鯽隨機分為3組，分別為HSP70促進組、HSP70抑制組和對照組，每組設(shè)3個平行，每個平行放置30尾異育銀鯽。HSP70抑制組每尾異育銀鯽以5 mg/kg劑量于背鰭后方注射槲皮素，HSP70促進組每尾異育銀鯽以0.75g/kg劑量于背鰭后方注射谷氨酰胺，對照組注射相同體積的0.65%的滅菌生理鹽水。均分兩次間隔4小時注射。取患病異育銀鯽的內(nèi)臟組織按1﹕6（w/v）0.65%滅菌生理鹽水制作組織勻漿，-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，5000 rpm離心10 min，所得上清液過0.45 μm濾膜除菌后，收集濾液置于4℃?zhèn)溆肹5]。將病毒液按每尾魚0.3 mL/尾的劑量進行腹腔注射，對照組每尾注射0.3 mL生理鹽水。病毒液于分別注射槲皮素和谷氨酰胺后24小時注射。注射槲皮素和谷氨酰胺后12小時采樣，樣品記為0 h，即為感染CyHV-2前樣本。

分別于注射病毒液后12 h，24 h，48 h，72 h和異育銀鯽已有明顯腹部腫脹、鰓部出血的癥狀時采樣。取肝臟、脾臟和腎臟組織，在DEPC水配制的PBS中漂洗后，經(jīng)液氮冷凍后，于-80℃保存。

1.2.2 ?血清生化指標的測定

對實驗組和對照組異育銀鯽進行尾靜脈采血，4℃ 3500 r/min離心10分鐘，收集血清，于美國雅培c8000全自動生化分析儀進行天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定。

1.2.3 ?異育銀鯽不同生理狀態(tài)下體內(nèi)HSP70的表達差異

采集經(jīng)過PCR鑒定檢出CyHV-2陽性并具有明顯鰓出血病癥狀的異育銀鯽肝臟，在DEPC水配制的PBS中漂洗后，經(jīng)液氮冷凍后，于-80℃保存。未檢出CyHV-2的健康異育銀鯽用同樣的方法采集組織樣品。各組織于液氮中研磨，進行總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)成cDNA第一鏈。以本實驗室異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組測序所得的數(shù)據(jù)庫中一條注釋為HSP70的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計引物，以肝臟cDNA為模板進行克隆，以所獲序列設(shè)計特異引物F：GGAGTCCTACGCCTTCAACA和R：TTGCAGACCTTCTCCAGCTC，以異育銀鯽β-actin基因序列（MF463002）設(shè)計內(nèi)參引物F： TGTCCCTGTATG CCTCTGGT和R： TGTAGCCTCTCTCGGTCAGG，以無菌水作為陰性對照。進行Real-time熒光定量PCR，反應(yīng)結(jié)果用2-ΔΔCt的方法進行分析[6]。用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 ?注射HSP70抑制劑和促進劑的異育銀鯽人工感染CyHV-2后體內(nèi)病毒數(shù)的測定

根據(jù)CyHV-2病毒編碼解旋酶序列（KM200722.1）設(shè)計引物F：ATGTGCAACGTGACGGCGAGT和 R：CTACCGTCTTTTAGGG，以病魚DNA為模板進行PCR反應(yīng)。將特異條帶克隆入DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后提取質(zhì)粒，并計算每毫升溶液中質(zhì)?？截悢?shù)。根據(jù)所得序列設(shè)計Real-time熒光定量PCR引物F： TGGAATCAGTTCAACGCGTCAT和 ?R： CGTCAGTGCCTGGCAG TAATA，將所得質(zhì)粒從102-108按10倍梯度稀釋，結(jié)合熒光定量PCR數(shù)據(jù)得出標準曲線及線性回歸方程[7]。

分別取一定量的注射生理鹽水、槲皮素或谷氨酰胺并人工感染CyHV-2后的異育銀鯽內(nèi)臟，經(jīng)快速提取DNA后，取2微升進行Real-time熒光定量PCR，根據(jù)Ct值計算組織中的病毒拷貝數(shù)。所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計處理，在單因素方差分析的基礎(chǔ)上，采用Duncan氏多重比較法檢驗組間差異（P=0.05）。

2 ?結(jié)果

2.1 ?異育銀鯽感染CyHV-2后HSP70的表達變化

養(yǎng)殖池塘自然發(fā)病的具有鰓出血病典型癥狀的異育銀鯽，其肝臟內(nèi)HSP70基因的表達量與健康異育銀鯽相比明顯地升高（P<0.01）（圖1）。人工感染CyHV-2病毒后，肝臟內(nèi)HSP70表達量在24h后顯著增加（P<0.05），隨后趨于正常;而當魚體表現(xiàn)出發(fā)病癥狀時，HSP70表達量極顯著上升（P<0.01）（圖2）。自然發(fā)病和人工感染CyHV-2發(fā)病的異育銀鯽體內(nèi)HSP70表達量的顯著升高說明HSP70與鰓出血病之間存在著一定的關(guān)系。

2.2 ?注射HSP70抑制劑、促進劑并人工感染CyHV-2后異育銀鯽血清中生化指標的變化

對照組在人工感染CyHV-2后，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量在72h內(nèi)相對平穩(wěn)，在魚體發(fā)病時顯著升高（P<0.05），且在發(fā)病時與注射促進劑和抑制劑組都有極顯著差異（P<0.01）。注射HSP70促進劑組在人工感染CyHV-2后，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12時顯著升高（P<0.05），后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，至發(fā)病時已和感染病毒前持平。注射HSP70抑制劑組在人工感染CyHV-2后，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12時開始升高，至24h達最高值（P<0.05），后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，至發(fā)病時已和感染病毒前持平（圖3）。

對照組在人工感染CyHV-2后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量在12 h時略有下降，24 h時略升高，48 h后又下降直至發(fā)病都很平穩(wěn)，但幾個時間點的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量和感染前相比都無顯著差異。注射HSP70促進劑組在人工感染CyHV-2后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12h時顯著升高（P<0.05），后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，至發(fā)病時已和感染病毒前持平。注射HSP70抑制劑組在人工感染CyHV-2后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12時開始升高并達最高值，后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，但和感染前相比同樣無顯著差異（圖4）。

2.3 ?注射HSP70抑制劑、促進劑并人工感染CyHV-2后異育銀鯽體內(nèi)的CyHV-2病毒數(shù)量

將含有病毒核酸的質(zhì)粒從102-108按10倍梯度稀釋后，進行實時熒光定量PCR，根據(jù)Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值獲得了線性回歸方程：y= -3.4789x +37.507，R2為0.99816。注射HSP70促進劑、抑制劑的異育銀鯽人工感染CyHV-2后，對其體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)注射HSP70抑制劑的異育銀鯽體內(nèi)病毒數(shù)在感染病毒后12 h時，就達到最高點，約為剛感染時的9倍（P<0.01），明顯高于對照組及注射HSP70促進劑組的同時間段病毒數(shù)（P<0.01）;隨后病毒數(shù)有所下降，但是至發(fā)病時，仍然遠遠高于感染初期。而對照組和注射HSP70促進劑組，在病毒的增殖趨勢及數(shù)量上，兩者都沒有明顯差異（圖5）。可見當異育銀鯽體內(nèi)的熱休克蛋白被人為抑制時，魚體對CyHV-2病毒的抵御能力大大下降，從而CyHV-2病毒得以在異育銀鯽體內(nèi)大量增殖，說明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的積極作用。

3 ?討論

熱休克蛋白是生物體在應(yīng)激條件下在體內(nèi)高效表達的一類蛋白質(zhì)，也是一種細胞保護蛋白。熱休克蛋白能抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶，并且能直接釋放或增加細胞內(nèi)的超氧化物歧化酶等抗氧化劑，從而使生物體具有更好的抗應(yīng)激能力[8，9]。在池塘自然感染CyHV-2病毒后患病的異育銀鯽體內(nèi)，HSP70在轉(zhuǎn)錄水平的表達量為正常值的7倍，而在人工感染CyHV-2后，在鰓出血病的急性爆發(fā)期，病魚體內(nèi)的HSP70 mRNA表達量更是驚人地高出對照組100多倍。說明異育銀鯽在感染CyHV-2后，為增強機體的應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)HSP基因的表達大量增強，以減少機體因感染病毒受到的損害。由于HSP70還能參與免疫復(fù)合物的形成，在體內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答[3]。因此，異育銀鯽在感染CyHV-2并發(fā)病后，機體為了盡快產(chǎn)生免疫復(fù)合物來防御入侵的病原，調(diào)動了體內(nèi)HSP70基因的大量表達。兩者疊加，造成了HSP70在表達水平的顯著升高。而人工感染后的發(fā)病魚體，其體內(nèi)的HSP70 mRNA 要遠高于池塘自然發(fā)病的個體，推測因為人工感染與自然傳播相比，用的劑量更大，病毒復(fù)制數(shù)目更多，發(fā)病的時間更短。

谷氨酰胺（Glutamine）是一種極有潛力的熱休克蛋白誘導(dǎo)劑，因其可誘導(dǎo)增強HSP70的表達，已在藥物開發(fā)中得到了一定的應(yīng)用[10，11]，而槲皮素（Quercetin）具有抑制熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯的功能[12-14]。在已知CyHV-2感染異育銀鯽能提高魚體內(nèi)HSP70基因的表達后，分別通過給魚體注射谷氨酰胺和槲皮素來提高或阻斷體內(nèi)的HSP70，并人工感染CyHV-2，通過不同時間點魚體內(nèi)病毒拷貝數(shù)的測定，發(fā)現(xiàn)HSP70與CyHV-2病毒的增殖間有密切的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)注射槲皮素的異育銀鯽體內(nèi)病毒數(shù)在感染病毒后12h時，就達到最高點，約為剛感染時的9倍，明顯高于對照組及注射谷氨酰胺組異育銀鯽的同時間點病毒數(shù);注射槲皮素組的異育銀鯽，體內(nèi)病毒數(shù)在12 h至最高峰后雖然接著有所下降，但是至發(fā)病時，仍然遠遠高于感染初期?？梢姰敭愑y鯽體內(nèi)的熱休克蛋白被人為減少時，魚體對CyHV-2病毒的抵御能力大大下降，從而CyHV-2病毒得以在異育銀鯽體內(nèi)大量增殖，說明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的積極作用。人工增加或減少魚體內(nèi)的HSP70，在相同的人工感染CyHV-2的條件下，魚體內(nèi)病毒的拷貝數(shù)有不同的呈現(xiàn)，這也解釋了CyHV-2引起的疾病常在水溫15℃～25℃發(fā)病的原因。水溫15℃～25℃，是異育銀鯽最適宜的生長溫度，在此溫度下，因溫度刺激產(chǎn)生的應(yīng)激最小，體內(nèi)熱休克蛋白的量處于一個相對低的水平，因此，當魚體感染CyHV-2時，對病毒的抵御能力較差，病毒增殖迅速，打破了機體自身與病毒造成損傷之間的平衡，鰓出血病往往容易爆發(fā)。而當水溫高于25℃或低于15℃時，水溫本身對魚體已經(jīng)產(chǎn)生了刺激，魚體內(nèi)熱休克蛋白量有所增加，從而促進魚體免疫復(fù)合物的形成，對病毒的增殖起了一定的抑制作用。所以即使魚體感染了CyHV-2，往往也能攜帶病毒生存，不會造成鰓出血病的大規(guī)模爆發(fā)。

血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）可反映肝細胞損傷的程度。肝臟承擔著魚體糖類、脂類、蛋白質(zhì)和維生素等物質(zhì)的代謝，當機體受到致病因子的侵害時，肝臟的結(jié)構(gòu)和功能會受到不同程度的損害，并引起相應(yīng)的代謝物紊亂[15]。劉文枝等的研究表明，異育銀鯽在人工感染CyHV-2后，血清中AST的含量會有顯著升高[5]，本研究也得到了相似的結(jié)果。本實驗中，對照組在人工感染CyHV-2后，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在魚體發(fā)病時顯著升高，且在發(fā)病時與注射HSP70促進劑和抑制劑組都有極顯著差異。注射HSP70促進劑和抑制劑組，血清中AST含量和感染CyHV-2前相比，并沒有明顯變化。說明人為地對異育銀鯽體內(nèi)的HSP70進行干預(yù)后，對因病毒造成的肝臟損傷產(chǎn)生了一定的拮抗，在一定程度上對機體起到了保護作用。相比之下，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶僅在注射HSP70促進劑組在人工感染CyHV-2后12 h時顯著升高，其他均無顯著差異。因此，血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)值可作為異育銀鯽鰓出血病輔助判別的血清指標。

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