張佳怡　王彤　白玉琢　李欣怡　魯曼　陳潔　許玥　張淑靜　張莉　劉通

摘要?目的：觀察不同電針介入時機對腰多裂肌損傷大鼠多裂肌叉頭蛋白（Foxo1）、肌肉生長抑制素（Myostatin）、成肌分化因子（Myod）蛋白表達的影響。方法：雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、即刻電針組、24 h電針組、48 h電針組，每組8只。以多裂肌肌注0.5%布比卡因復制腰多裂肌損傷模型。各電針組分別在造模后即刻、24 h、48 h開始電針雙側“委中”“腎俞”，連續(xù)干預7 d。以Western blot檢測各組多裂肌Foxo1、Myostatin、Myod蛋白表達水平。結果：與空白組比較，模型組Foxo1、Myod蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，即刻電針組、48 h電針組Foxo1、Myostatin蛋白表達水平降低（P<0.01，P<0.05），24 h電針組Foxo1、Myostatin蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），Myod蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與24 h電針組比較，即刻電針組Myostatin蛋白表達水平升高（P<0.05）、Myod蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），48 h電針組Foxo1蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）、Myod蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。結論：電針促進多裂肌修復的最佳介入時機可能為損傷后24 h。

關鍵詞?電針;針刺時機;多裂肌損傷;叉頭蛋白;肌肉生長抑制素;成肌分化因子;肌衛(wèi)星細胞;骨骼肌修復

Effects of Electroacupuncture Intervention Time on the Expression of Foxo1，Myostatin and Myod in Rats with Multifidus Muscle Injury

Zhang Jiayi1，Wang Tong1，Bai Yuzhuo1，Li Xinyi1，Lu Man1，Chen Jie1，Xu Yue1，Zhang Shujing2，Zhang Li1，Liu Tong3

（1 College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 3 The Fifth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of different electroacupuncture intervention time on the expression of multifidus muscle fork protein（Foxo1），Myostatin and myoblast differentiation factor（Myod）in rats with lumbar multifidus muscle injury. Methods：Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the blank group（BG），model group（MG），immediate/24 h/48 h electroacupuncture group（0 hG/24 hG/48 hG），with 8 rats in each group. The lumbar multifidus muscle injury model was replicated with 0.5% bupivacaine in the multifidus muscle. Each electroacupuncture group started the electroacupuncture on both sides of the Weizhong（BL40）and Shenshu（BL23）at 0 h/24 h/48 h after modeling，and continuous intervention for 7 days. Western blot was used to detect the expression levels of Foxo1，Myostatin and Myod proteins in multifidus muscles of each group. Results：Compared with the BG，the expression of Foxo1 and Myod proteins in the MG significantly increased（P<0.01）; Compared with the MG，the expression of Foxo1 and Myostatin in the 0 hG and 48 hG were decreased（P<0.01，P<0.05）. The expression of Foxo1 and Myostatin in the 24 hG significantly decreased（P<0.01），and Myod protein expression was significantly increased（P<0.01）. Compared with the 24 hG，the expression of Myostatin protein in 0 hG increased（P<0.05），and the expression of Myod protein in 0 hG significantly decreased（P<0.01）; the expression of Foxo1 protein in 48 hG was significantly increased（P<0.01），and the expression of Myod protein was significantly decreased（P<0.01）. Conclusion：The best intervention time is 24 h after injury，wich can effectively promote multifidus muscle repairing.

Key Words?Electroacupuncture; Acupuncture time; Multifidus muscle injury; Fork protein; Myostatin; Myogenic differentiation factor; Muscle satellite cell; Skeletal muscle repair

中圖分類號：R274.3;R245.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.016

多裂肌是附著面積最大的椎旁肌，對維持腰椎穩(wěn)定以及控制脊柱活動起到關鍵性的作用。近年來越來越多國內外學者聚焦于多裂肌的康復和功能訓練[1-2]，以期通過促進多裂肌損傷后修復改善腰背功能障礙。骨骼肌損傷后修復主要依賴骨骼肌干細胞-肌衛(wèi)星細胞（Muscle Satellite Cells，MSCs）的增殖與分化。研究證明[3-4]MSCs的增殖與分化過程有多種細胞因子及蛋白的參與，其中叉頭蛋白（Foxo1）、肌肉生長抑制素（Myostatin）及成肌分化因子（Myod）均與MSCs的增殖密切相關。Foxo1可調節(jié)Myostatin的表達，與MSCs的增殖呈負相關;Myostatin可負調節(jié)MSCs最重要的生肌調節(jié)因子Myod的表達進而調控肌細胞分化[5]。課題組前期研究[6-7]已證實電針可有效促進多裂肌損傷后修復，但電針介入的最佳時機尚未明確。肌肉損傷后24 h內為炎性反應階段，24 h即出現(xiàn)生肌相關因子的募集，48 h后炎性反應減退。因此本實驗以損傷后即刻、24 h、48 h為介入時機，通過觀察在大鼠多裂肌損傷后即刻、24 h、48 h進行電針干預對多裂肌中Foxo1、Myostatin、Myod蛋白表達的影響，進一步探討電針促進腰多裂肌損傷后修復可能的作用機制，并篩選電針促進多裂肌損傷后修復的最佳介入時機。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級雄性SD大鼠40只，體質量280～320 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號SCXK（京）2016-0002。隨機分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，明暗周期12 h，環(huán)境溫度24 ℃，濕度40%～50%，適應性喂養(yǎng)10 d。

1.1.2?試劑與儀器?主要試劑：布比卡因鹽酸鹽（Signa公司，美國，80-477-DK）;10%水合氯醛（北京歐北生物科技有限公司，批號780379）;4%多聚甲醛溶液（北京蘭博利德，批號90090525）;蛋白marker（Thermo公司，美國，批號MS-612-P1ABX）;RIPA裂解液;一抗稀釋液;電泳緩沖液;電轉緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司，批號C1503）;TBST液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號T1081-500）;Foxo1兔抗體、Myod鼠抗體（Abcam公司，批號EP927Y）;Myostatin（Proteintech公司，美國，批號19142-1-AP）;Beta Actin抗體（Abcam公司，美國，批號mAbcam8226）;山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京百諾威生物科技有限公司，批號ZB-2301）;PVDF膜（MLIPLE公司，美國，批號IPVH00010）;ECL發(fā)光液（GE Healthcare公司，英國，批號RPN2232）。主要儀器：HANS穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，型號LH202H型）;蛋白質電泳及轉膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號170-4155 Trans-Blot Turbo Starter System）;凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech公司，美國，型號Fluor Chen FC2）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?分組采用完全隨機方法將40只大鼠分為空白組、模型組、即刻電針組、24 h電針組、48 h電針組，每組8只。采用一次性肌肉局部注射0.5%布比卡因制備大鼠腰部多裂肌損傷模型。配制10%的水合氯醛（350 mg/kg），對大鼠進行腹腔麻醉，背部備皮，選擇L4-L5水平，在脊柱雙側共4個點，使用一次性注射器緊貼脊柱進針，針達骨面即止，回抽無血即可注射，每個點注射0.5%的布比卡因溶液100 μL，共400 μL，旋轉針頭拔出，操作過程保持無菌。

1.2.2?干預方法?各電針組分別從造模后即刻、24 h、48 h開始干預，將大鼠固定在操作臺上，暴露背部和后肢，參照《實驗針灸學》（李忠仁，新世紀全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材，中國中醫(yī)藥出版社）常用實驗動物穴位圖譜，選取雙側委中穴、腎俞穴進行干預。于大鼠膝關節(jié)背面正中取委中穴;于大鼠第2腰椎旁開7 mm取腎俞穴。針刺前以75%乙醇消毒，選用華佗牌13 mm一次性針灸針垂直刺入穴位表面皮膚，針刺后連接韓式電針儀HANS-200A，2/100 Hz的疏密波，電流強度1 mA，持續(xù)20 min，1次/d，連續(xù)干預7 d后取材;模型組、空白組不做任何處理于實驗最后1 d取材。以10%水合氯醛（350 mg/kg）進行腹腔麻醉。使大鼠處于深度麻醉狀態(tài)后固定于鼠板上，充分暴露背部。剪開大鼠背部皮膚，以組織剪、鑷子剝離腰部筋膜，于L4、L5兩側取下大鼠的腰部多裂肌，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3?檢測指標與方法?運用Western Blot法測定各組大鼠多裂肌中Foxo1、Myostatin、Myod蛋白含量。1）提取蛋白：將取材所得組織置于裂解液中，低溫下勻漿取上清液，并配置標準液測蛋白濃度，配平后沸水煮5 min，室溫下降溫。2）電泳：將提前制好的10%丙烯酰胺凝膠置于電泳槽中，電泳緩沖液沒過膠塊，marker上樣3 μL，每組蛋白樣品上樣10 μL，先在80 V的電壓下電泳20 min，再在120 V電壓下電泳100 min;3）電轉：將電泳完畢的膠塊修切整齊，與PVDF膜利用三明治夾緊貼置于電轉槽內，在80V的電壓下電轉70 min，之后將膜封閉搖床1 h以上;4）孵一抗：根據(jù)marker剪膜加入一抗封閉，4 ℃過夜（Foxo1、Myostatin一抗按1∶1 000稀釋;Myod一抗按1∶500稀釋）;TBST液搖床清洗3次，10 min/次;5）孵二抗：加入二抗（Foxo1、Myostatin二抗按1∶2 000稀釋;Myod二抗按1∶1 000稀釋），搖床1 h;TBST液清洗6次，5 min/次;6）曝光及灰度值分析：ECL發(fā)光液顯色并置于機器曝光，得到條帶圖像用quantity one軟件定量分析Foxo1、Myostatin、Myod的灰度值，并取指標與Beta Actin的吸光度的比值進行統(tǒng)計分析。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。每組樣本數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間差異用單因素方差分析（One-Way ANOVA）/獨立樣本t檢驗進行分析，方差齊性時兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Welch檢驗，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?Western Blot檢測各組大鼠多裂肌Foxo1表達的比較?與空白組比較，模型組Foxo1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，即刻針刺組、48 h針刺組Foxo1蛋白表達水平均降低（P<0.01，P<0.05），24 h針刺組Foxo1蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）;與24 h針刺組比較，即刻針刺組Foxo1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），48 h針刺組Foxo1蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。見表1，圖1、圖2。

2.2?Western Blot檢測各組大鼠多裂肌Myostatin表達的比較?與空白組比較，模型組Myostatin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與模型組比較，即刻針刺組、48 h針刺組Myostatin蛋白表達水平均降低（P<0.01，P<0.05），24 h針刺組Myostatin蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）;與24 h針刺組比較，即刻針刺組Myostatin蛋白表達水平升高（P<0.05），48 h針刺組Myostatin蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1，圖1、圖2。

2.3?Western Blot檢測各組大鼠多裂肌Myod表達的比較?與空白組比較，模型組Myod蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，即刻針刺組、48 h針刺組Myod蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），24 h針刺組Myod蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與24 h針刺組比較，即刻針刺組Myod蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），48 h針刺組Myod蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。見表1，圖1、圖2。

3?討論

髂肋肌、最長肌及多裂肌共同維持脊柱穩(wěn)定，其中多裂肌與腰椎連接緊密且距中軸最近，在脊柱突然失衡時可預先收縮，減少腰椎節(jié)段位移，對抗腰椎旋轉及滑動，維持脊柱正常力線。而多裂肌損傷導致其預激活延遲、協(xié)調能力降低，維持腰椎穩(wěn)定的功能失常[8]。大量研究已證實電針干預可促進肌肉損傷后線粒體聚集抑制肌肉瘢痕性修復[9]、顯著上調骨骼肌結蛋白（Desmin）等成肌分化標志蛋白的表達[10]、使損傷局部炎性反應高峰期提前并加速其消退[11]，進而發(fā)揮促進肌肉損傷后修復的作用。本課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，以局部、遠端取穴相配，取兩側“委中”穴、“腎俞”穴為治療點，發(fā)揮針刺行氣活血、疏通經(jīng)絡的作用。而針刺時機作為針灸處方重要組成部分，電針干預治療骨骼肌損傷的最佳介入時機尚未見統(tǒng)一論述。炎性反應在肌肉損傷2 h即可出現(xiàn)，首先表現(xiàn)為損傷局部中性粒細胞浸潤，在6～24 h可達高峰，其后逐漸下降;24 h后Myod等生肌因子表達開始肌肉修復，并出現(xiàn)巨噬細胞浸潤在48 h達到高峰，其后逐漸降低;48 h后炎性反應逐漸消退。有研究認為炎性反應階段電針介入會加重炎性反應[12]，而一些研究則認為電針早期介入會促進MSCs增殖高峰期提前[13]。究竟肌肉損傷后在何時開始電針介入才能達到最佳治療效果呢？本實驗分別以多裂肌損傷后即刻、24 h、48 h為電針介入時間點，篩選電針治療多裂肌損傷的最佳介入時機。

肌衛(wèi)星細胞（Muscle Satellite Cells，MSCs）是具有增殖和自我更新能力的成肌前體細胞，骨骼肌損傷后修復主要依賴于MSCs的增殖與分化[14]。Myod是參與MSCs增殖的最重要的生肌調節(jié)因子，直接反映MSC增殖活性并促進成肌分化。Myostatin是一種負向調節(jié)骨骼肌發(fā)育的分泌型蛋白，大量研究證實Myostatin通過下調Myod的表達抑制了肌細胞分化[15-16]，調控MSCs的增殖和分化[17]。Foxo1是調控肌肉生長、代謝和細胞分化的重要轉錄因子，其表達與MSC增殖呈負相關[18]。研究顯示Foxo1可上調Myostatin的表達，抑制MEF2C、Myod和mTOR的表達對成肌細胞的早期分化產(chǎn)生負調節(jié)作用[19]。而抑制Foxo1活性在下調Myostatin表達的同時促進了Myod的表達，加速肌肉修復[20]。因此，本實驗以多裂肌Foxo1、Myostatin及Myod蛋白表達為觀察指標，結合不同的電針介入時間點，進一步探討電針干預促進多裂肌損傷后修復的最佳干預時機及起效機制。

本研究探索不同電針介入時機治療腰部多裂肌損傷的時效作用，采用Western Blot定量檢測Foxo1、Myostatin及Myod蛋白表達的變化，證實電針可下調腰部多裂肌損傷模型Foxo1、Myostatin蛋白的表達，且最佳時機針刺可上調Myod蛋白的表達，證實針刺治療可有效促進肌衛(wèi)星細胞增殖實現(xiàn)腰多裂肌損傷后修復。劉通[21]等觀察針刺血清可上調Myod的表達促進肌衛(wèi)星細胞增殖，均與我們的研究證實針刺通過調節(jié)Myostatin、Myod蛋白表達發(fā)揮骨骼肌保護作用相一致。本實驗結果顯示，多裂肌損傷后24 h針刺組其治療效果優(yōu)于即刻針刺組（P<0.05），并明顯優(yōu)于48 h針刺組（P<0.01）。結果表明多裂肌損傷后24 h針刺為最佳干預時機，對Foxo1、Myostatin蛋白的抑制作用最優(yōu)，更好的發(fā)揮針刺對肌生成抑制因子的下調作用，進而上調Myod蛋白表達促進多裂肌再生，實現(xiàn)肌肉損傷后修復。目前對針刺介入時機治療疾病的探討多以腦卒中、周圍性面癱為主，而對針刺治療骨骼肌損傷的介入時機研究較少。研究證實腦卒中、周圍性面癱[22]在急性期早期針刺介入療效均優(yōu)于恢復期介入效果，總體呈現(xiàn)為針刺介入越早愈后越佳的趨勢。本實驗結果顯示肌肉損傷后即刻電針介入并非促進肌肉損修復的最佳時機，損傷后24 h電針介入療效最優(yōu)。我們認為其可能原因是不同疾病最佳針刺介入時機確有不同，本實驗的開展為臨床治療骨骼肌損傷選擇針刺介入時機提供了思路及可行依據(jù)。

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