朱守晶 肖祥云 史文娟

關鍵詞：NRAMP2基因;克隆;序列分析;苧麻

中圖分類號：S563.101

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0749-04

重金屬是主要的環(huán)境污染物之一，所有重金屬對生物都有潛在的危害作用[1-6]。天然抗性相關巨噬細胞蛋白家族（Natural resistance-associated macrophage protein， NRAMP）是一類廣泛存在于微生物、植物、動物中的古老且高度保守的膜整合蛋白家族，參與大多數(shù)有機體的金屬離子（如Fe2+、Cd2+、Mn2+、2n2+、Cu2+、NjZ+、C02+、Al3+）的運輸[7-9]。目前，已在許多高等植物中發(fā)現(xiàn)了NRAMP家族基因。在擬南芥（Ar-abidopsis thaliana）和水稻（Oryza saliva）基因組中，分別存在6和7個NRAMP家族成員，其中一些NRAMP基因的功能已經(jīng)比較清楚。擬南芥中的Nrampl、Nramp3和Ⅳramp4基因可以轉運Mn、Fe和Cd[10-12]，而Nramp6只能轉運Cd[13]。在水稻中也有相關報道，Takahashi等研究發(fā)現(xiàn)OsNrampl基因與水稻根系對鎘的吸收和轉運過程密切相關，該基因在水稻根部表達量的差異也導致水稻品種間的鎘積累量呈現(xiàn)差異[14]。Sasaki等將敲除了Nramp5基因的水稻突變體與野生型水稻植株同時種植在含錳和鎘的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)突變體根中錳和鎘的含量及其凈吸收量都顯著低于野生型[15]。這些發(fā)現(xiàn)促進了對植物Nramp基因轉運金屬離子的研究，也表明Nramp基因在重金屬抗性中起著重要作用。

苧麻（Boehmeria niveaL）為蕁麻科苧麻屬多年生宿根性草本植物[16]。許多研究結果表明，苧麻對重金屬鎘（Cd）具有較強的耐受和富集能力[17-20]。雖然對其他植物的研究結果表明，NRAMP家族基因在植物對鎘的吸收和轉運過程中起著關鍵作用，但目前在苧麻中尚未得到克隆。本研究在苧麻轉錄組測序的基礎上[21]，篩選與擬南芥Nramp2基因同源性較高的苧麻Nramp基因，設計引物通過RT-PCR克隆該基因的開放讀碼框，并對其進行生物信息學分析，以期為后續(xù)的表達分析及功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為耐鎘性較強的苧麻栽培品種中苧一號，種植于宜春學院苧麻資源圃。在苧麻旺長期，選擇生長健壯、無病蟲害的植株，剪取根部和葉片，液氮速凍，然后置于-80℃超低溫冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 生化試劑

RNA提取試劑RNAprep pure plant kit購自天根生化科技（北京）有限公司，PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAeraser和pMD18-T載體購自TaKaRa公司（日本），Trans2Kplus II DNA marker、TransTaq@ HiFi DNA polymerase、大腸桿菌化學感受態(tài)細胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，其余試劑均為國產分析純或者化學純。引物合成和測序由上海生工生物技術服務有限公司完成。

1.3 RNA提取及cDNA合成

按照天根RNAprep pure plant kit試劑盒說明書提取苧麻樣品總RNA。按照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent kit withgDNA eraser試劑盒說明書將RNA反轉錄為第一鏈cDNA。

1.4 BnNramp2基因的克隆

基于苧麻鎘脅迫轉錄組中的Unigene拼接序列，利用Primer Premier 5.O軟件在開放讀碼框外側設計一對特異性引物BnNramp-F（5’-CCGCATCCCCCTCGGCAAATCTCCC-3’）和BnNramp-R（5’-CCTATTTCTGCTCCCACTTCACTTCT-3’），以苧麻cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系為：第一鏈cDNA l.0μl，Buffer 2.5μl，上、下游引物（10 μmol/L）各1.Oμl，dNTP（2.5μmol/L）2.0μl，TransTaq@HiFi DNApolymerase 0.2μl，ddH20 17.5μl。反應程序為：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，32個循環(huán);72℃延伸7 min，最后4℃保溫。PCR產物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，將回收產物連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR鑒定后，送陽性克隆至上海生工生物技術服務有限公司進行序列測定。

1.5 BnNramp2基因的生物信息學分析

通過NCBI（美國國立生物技術信息中心）數(shù)據(jù)庫的ORF Finder工具（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對BnNramp2基因的開放讀碼框進行查找，并將其翻譯成氨基酸序列;利用ExPASy數(shù)據(jù)庫的ProtParam工具（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）對BnNramp2編碼氨基酸的組成和理化性質進行分析;利用ExPASy數(shù)據(jù)庫的TMpred工具（ https：//embnet. vital-it. ch/software/TMPRED—form.html）對蛋白質的跨膜結構域進行預測;利用WoLF PSORT在線軟件（ https：//www.genscript.com/wolf-psort，html）預測BnNramp2蛋白的亞細胞定位;采用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件對蛋白質的信號肽序列進行預測;用SOPMA在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）預測分析蛋白質的二級結構;在NCBI數(shù)據(jù)庫中對氨基酸序列進行BLAST相似性檢索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）;利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Conserveddomain search程序（https： //www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白質保守功能域預測;在DNAMAN 8.O軟件中進行氨基酸序列的多重比對;利用MECA 5.0軟件采用Neighbor-Joining方法構建蛋白質系統(tǒng)進化樹，Bootstrap統(tǒng)計學檢驗次數(shù)為500。

2 結果與分析

2.1 苧麻BnNramp2基因的克隆

按照試劑盒說明書提取耐鎘苧麻品種中苧一號根部和葉片總RNA，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，可以看到清晰的28S和18S條帶.且28S條帶亮度是18S的2倍左右，基本沒有降解，可以滿足下一步試驗要求。將根部和葉片總RNA等量混合，反轉錄為cDNA模板。采用BnNramp-F和Bn-Nramp-R引物進行PCR擴增，得到1條1 800 bp左右的特異性條帶。切膠回收后連接至pMD18-T載體，送至上海生工生物技術服務有限公司進行測序。采用NCBI網(wǎng)站的OR-Ffinder軟件對測得的序列進行ORF查找，結果表明苧麻Bn-Nramp2基因含有一個長度為1596 bp的開放讀碼框，位于92-1 687 bp處，編碼531個氨基酸，與GenBank已登錄的其他植物的Nramp2基因相似性較高，將其命名為BnNramp2。

2.2 苧麻BnNramp2蛋白基本性質預測

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫的ProtParam工具對BnNramp2基因推導的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質的分子量為5.874x104，等電點為5. 36，含有20種氨基酸，含量最高的為亮氨酸（ 13.6%），含量最低的為半胱氨酸（0.9%），分子式為C2 709 H4 239N677 0742 S18。蛋白質不穩(wěn)定系數(shù)為40. 18，為不穩(wěn)定蛋白質。利用TMpred工具對BnNramp2的跨膜結構域進行預測，結果表明，BnNramp2蛋白含有12個可能的跨膜區(qū)域，對應的氨基酸殘基區(qū)域分別為72- 90、106- 123、149-173、180- 201、211- 228、255- 274、302- 321、347- 368、391-412、424- 443、460-477、484- 508。利用WoLF PSORT軟件對BnNramp2的亞細胞定位進行預測，結果表明BnNramp2蛋白質定位于質膜處。SignaIP 4.1 Server軟件分析結果表明，BnNramp2蛋白不含信號肽序列，不屬于分泌型蛋白質。

2.3 苧麻BnNramp2蛋白二級結構預測

利用PRABI網(wǎng)站的SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）對BnNramp2蛋白進行二級結構預測，推測該蛋白質主要由a螺旋（a-helix）、延伸鏈（Extended strand）、β一轉角（ Beta turn）和無規(guī)則卷曲（Random coil）結構組成，比例分別為54. 80%、12. 62%、3.01%和29. 57%.

2.4 BnNramp2蛋白氨基酸序列比對和結構域分析

利用DNAMAN 8軟件對苧麻BnNramp2蛋白和其他植物物種的Nramp蛋白進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)苧麻BnNramp2蛋白與擬南芥、川桑、山黃麻、桃和梅Nramp2蛋白的相似性較高，相似度分別為80%、86%、84%、83%和83%。利用NCBI的CD-search和ExPASy數(shù)據(jù)庫PROSITE軟件分析氨基酸序列的保守結構域，發(fā)現(xiàn)BnNramp2蛋白的第92- 455位氨基酸殘基為典型的Nramp結構域，同時在第410- 413氨基酸殘基處存在一個Ⅳ-糖基化位點（N-glycosylation site），屬于Nramp超家族。

2.5 苧麻BnNramp2蛋白統(tǒng)進化分析

為進一步研究苧麻BnNramp2蛋白在物種中的進化位置和親緣關系，利用MECA 5.O軟件對苧麻、川桑、山黃麻、水稻、玉米等不同植物物種的Nramp2氨基酸序列進行進化樹分析比較。結果表明，單子葉和雙子葉植物Nramp2蛋白明顯被聚成2類。苧麻BnNramp2與同為蕁麻目的川桑、山黃麻親緣關系最近，聚為一個亞類，而與單子葉的水稻、玉米的親緣關系最遠。薔薇目的桃、梅和甜櫻桃，錦葵目的棉花、長蒴黃麻，豆科的花生、野生大豆，十字花科的擬南芥、天藍遏藍菜和油菜，均分別聚為一個亞類。

3 討論

植物對土壤中礦質營養(yǎng)元素的吸收與重金屬元素的吸收積累關系密切。以往的研究結果表明，砷、鎘等有毒重金屬元素是通過礦質營養(yǎng)元素的吸收運輸通道進入并在植物體中進行分布的[14-15，22]。轉運蛋白不僅在植物礦質營養(yǎng)元素的運輸過程中起到重要作用，同時也可轉運重金屬元素。Nramp是一類古老的膜整合蛋白家族，雖然經(jīng)過長期進化，Nramp基因在各物種之間仍保持著高度的保守性，并在植物吸收轉運重金屬的過程中起到十分重要的作用[13-15，23]。雖然目前已在一些植物中克隆了多個Nramp家族基因，但在苧麻中至今未見報道。本研究采用RT-PCR技術，首次從耐鎘苧麻品種中苧一號中成功克隆了BnNramp2基因的全長編碼序列。

Nramp家族成員均為具有膜整合蛋白特征的多肽分子，通常含10-12個跨膜區(qū)、1-2個糖基化位點和1個具有轉運蛋白特征的結構域[24]。本研究對苧麻BnNramp2基因推導的氨基酸序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)第92-455氨基酸殘基含有一個Nramp蛋白結構域，并在第410 - 413氨基酸殘基處存在一個N一糖基化位點。對BnNramp2跨膜結構域的預測結果表明，BnNramp2蛋白含有12個可能的跨膜區(qū)域。亞細胞定位預測結果表明，BnNramp2蛋白定位于質膜。以上結果說明，苧麻BnNramp2具有NRAMP蛋白家族的重要特征，是一個典型的Nramp蛋白家族成員。 序列相似性比對和系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，苧麻Bn-Nramp2蛋白與其他植物Nramp2蛋白的相似性及同源性較高，很有可能為Nramps2家族成員。Cao等[25]研究了Cd超積累和非超積累2種類型東南景天在Cd誘導下的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，Nramp2基因在2種生態(tài)型東南景天中表達差異并不顯著，但在Cd誘導條件下，Nramp2基因在超積累東南景天中的表達水平要顯著高于非超積累生態(tài)型，轉運蛋白基因在超積累植物中的超量表達可能是其超積累Cd的關鍵。趙首萍等[26]研究了高Cd積累和低Cd積累2種基因型番茄對Cd脅迫響應的差異，發(fā)現(xiàn)高Cd積累型番茄的根系對離子態(tài)Cd的高吸收速率與Nramp2、Nramp3和ZIP基因的高表達量有關，可能是其獲得高鎘積累量的原因之一。這些結果表明，Nramp2基因參與了Cd的吸收轉運，因此BnNramp2基因可能與苧麻體內重金屬Cd的吸收轉運有關。

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（責任編輯：張震林）