孫健　李麗敏　胡青　諸艷蓉　毛秀紅　季申

摘要?目的：建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定注射用銀杏葉提取物及其制劑中總銀杏酸的方法。方法：采用HLB固相萃取凈化制劑，Waters Cortecs T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），以甲醇-1%冰醋酸溶液（90∶10）為流動相，在電噴霧離子化負離子模式下，以多反應監(jiān)測方式（MRM）檢測。結(jié)果：銀杏酸C13：0、C15：1、C17：1在0～50 ng/mL范圍內(nèi)成良好線性關系，相關系數(shù)均大于0.999;平均加樣回收率為97.3%～115.2%，相對標準偏差（RSD）為0.3%～3.4%;檢出限分別為0.03、0.06、0.04 mg/kg。結(jié)論：本方法可應用于實際樣品的測定。

關鍵詞?銀杏葉提取物;注射劑;銀杏酸C13：0;銀杏酸C15：1;銀杏酸C17：1;超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜;多重反應監(jiān)測;固相萃取

Determination of Ginkgolic Acids in the Ginkgo Biloba Extract for Injection and its Preparation

Sun Jian，Li Limin，Hu Qing，Zhu Yanrong，Mao Xiuhong，Ji Shen

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To develop an analytical method for determination of ginkgolic acids in the ginkgo biloba extract for injection and its preparation by ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry.Methods：The preparations were purified by HLB SPE.A chromatographic column，Waters Cortecs T3（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），was used with methanol-1% acetic acid（90∶10）as the mobile phase.The ginkgo acids were detected by electrospray ionization mass spectrometry in negative mode with multiple reaction monitoring（MRM）mode.Results：Ginkgo Acid C13：0，C15：1 and C17：1 possessed good linear correlation in the mass concentration range from 0 to 50 ng/mL，with the correlation coefficients more than 0.999.The mean recoveries were in the range of 97.3%-115.2%，and the RSDs were 0.3%-3.4%.The limits of quantification were 0.03，0.06，0.04 mg/kg，respectively.Conclusion：The method could be applied to the analysis of ginkgolic acids in actual samples.

Key Words?Ginkgo biloba extract; Injection; Ginkgolic acid C13：0; Ginkgolic acid C15：1; Ginkgolic acid C17：1; Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Multiple reaction monitor; Solid-phase extraction

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.006

銀杏葉提取物為銀杏科植物銀杏的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物，其主要功效為活血化瘀通絡。其注射劑多用于改善微血管循環(huán)、治療缺血性心腦血管疾病等。

銀杏酸是銀杏葉提取物中最主要的毒性物質(zhì)，具有潛在的致敏、致突變作用和強烈的細胞毒性作用[1-2]。銀杏酸是6-烷基或6-烯基水楊酸的衍生物，主要包括銀杏酸C13：0、C15：0、C15：1、C17：1、C17：2，化學結(jié)構(gòu)見圖1。其中C13：0、C15：1、C17：1占總銀杏酸的94%以上[3]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版[4]規(guī)定銀杏葉提取物中總銀杏酸含量不得過百萬分之十。美國藥典和歐洲藥典以3種銀杏酸含量之和作為總銀杏酸含量[5]，規(guī)定總銀杏酸含量不得過百萬分之五。而注射劑作為高風險劑型，應當更加嚴格控制其含量。

目前，文獻[6-10]多采用HPLC法測定銀杏葉提取物中總銀杏酸含量，但受限于該方法的靈敏度，檢出限已接近百萬分之十的限度，不能滿足更加嚴格的限量控制要求。為提高靈敏度和專屬性，亦有文獻采用LC/MS法[11]、GC/MS法[12]、二維液相色譜法[13]等。

作者團隊近年來已針對多種基質(zhì)開發(fā)了UHPLC/MS/MS法測定其中總銀杏酸含量（3種主要銀杏酸C13：0、C15：1、C17：1總量）[14-15]。因注射用銀杏葉提取物更加嚴格的限量控制（不得過百萬分之二），且其制劑杏芎氯化鈉注射液中銀杏葉提取物含量極低（約110 μg/mL）、基質(zhì)復雜（磷酸川芎嗪、氯化鈉等輔料），目前缺乏相關研究。本文建立了UHPLC-MS/MS法解決靈敏度問題，采用的固相萃取前處理技術解決制劑純化富集的問題。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀;Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜;Waters Cortecs T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）;Waters Oasis HLB固相萃取柱（規(guī)格：1 g/20 mL）。

1.2?試劑

銀杏酸C13：0對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111690-200501）、銀杏酸C15：1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111762-200601），銀杏酸C17：1對照品（同田生化公司，純度98.0%，批號：16040916）;甲醇、乙腈、醋酸、甲酸均為色譜純。

1.3?分析樣品

10批注射用銀杏葉提取物和3批杏芎氯化鈉注射液均為生產(chǎn)企業(yè)弘和制藥有限公司提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜質(zhì)譜條件?采用Waters Cortecs T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），以甲醇-1%冰醋酸溶液（90∶10）為流動相，待測成分全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液（99∶1）充分清洗至少10倍柱體積;對照品溶液及提取物供試品溶液進樣量1 μL，注射液進樣量5 μL。

電噴霧離子化（ESI）負離子模式;干燥氣（N2）流速15 L/min，溫度225 ℃;霧化氣（N2）0.21 MPa;鞘氣（N2）流速11 L/min，溫度300 ℃;毛細管電壓3 000 V。采用多反應監(jiān)測方式（MRM）檢測，監(jiān)測離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

2.2?對照品溶液的制備?分別取銀杏酸C13：0對照品、銀杏酸C15：1對照品、銀杏酸C17：1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成各含50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0 ng/mL的系列混合溶液，作為對照品溶液。

2.3?供試品溶液的制備?1）注射用銀杏葉提取物：取本品粉末約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲（功率180 W，頻率42 kHz）20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。2）杏芎氯化鈉注射液：精密量取樣品1 000 mL，上Waters oasis HLB固相萃取柱（規(guī)格：1 g/20 cc，預先依次用10 mL甲醇和10 mL水活化）上，用80%甲醇10 mL清洗，棄去洗液，再用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液并定容至25 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4?專屬性試驗?取注射液空白樣品（缺銀杏葉提取物），同2.3 2）制備空白溶液，進樣測定，結(jié)果空白無干擾。

2.5?線性關系考察?分別取銀杏酸C13：0對照品、銀杏酸C15：1對照品、銀杏酸C17：1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0 ng/mL的系列混合溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1 μL，注入液相質(zhì)譜儀，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結(jié)果表明，各銀杏酸線性關系良好。見表2。

2.6?中間精密度試驗?為考察隨機變動因素對精密度的影響，按照擬訂的方法，由不同的分析人員在不同的日期、不同儀器設備對3批樣品進行了含量測定。結(jié)果表明，由不同的分析人員在不同的日期、不同儀器設備上測得的結(jié)果基本一致，方法的中間精密度良好。見表3。

2.7?供試品溶液穩(wěn)定性試驗?取供試品溶液，分別于制備好后放置0 h、12 h、21 h時進樣測定。結(jié)果表明，銀杏酸C13：0、C15：1和C17：1的峰面積RSD分別為8.2%、5.2%和6.2%，基本穩(wěn)定。

2.8?重復性試驗?取注射用銀杏葉提取物，一式6份，制備6份供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算峰面積/稱樣量，結(jié)果表明，方法的重復性良好。見表4。

2.9?回收率試驗?取注射用銀杏葉提取物（經(jīng)檢測銀杏酸C13：0含量0.058 mg/kg，銀杏酸C15：1含量0.076 mg/kg，銀杏酸C17：1含量0.083 mg/kg），研細，取約0.4 g，一式九份，精密稱定，以三份為一組，分別添加低（0.125 mg/kg）、中（0.625 mg/kg）、高（1.25 mg/kg）3個水平的對照品溶液，每個水平做3個平行樣，共9份，按上述2.3供試品溶液的制備方法1）和2.1色譜質(zhì)譜條件進行分析。

精密量取杏芎氯化鈉注射液（經(jīng)檢測銀杏酸C13：0含量4 ng/L，銀杏酸C15：1含量5 ng/L，銀杏酸C17：1含量8 ng/L）1 000 mL，一式6份，添加0.1 μg/L水平的對照品溶液，按上述2.3供試品溶液的制備方法2）和2.1色譜質(zhì)譜條件進行分析。

結(jié)果表明，加樣回收率良好，方法準確度高。見表5。

2.10?檢出限?三重四極桿質(zhì)譜因其高度專屬性，噪聲較低，以信噪比計算檢出限結(jié)果易失真。因此本文以供試品溶液多級稀釋，以實際檢出濃度作為檢出限。結(jié)果銀杏酸C13：0、C15：1和C17：1的檢出限分別為0.03 mg/kg、0.06 mg/kg和0.04 mg/kg，滿足總銀杏酸百分之二的限度檢查要求。

2.11?樣品測定結(jié)果?對企業(yè)提供的10批注射用銀杏葉提取物和3批杏芎氯化鈉注射液進行測定，銀杏酸MRM色譜圖見圖2，結(jié)果見表6和表7，均符合原料百萬分之二的限度要求。

3?討論

3.1?檢測指標?銀杏酸主要包括5個成分，中華人民共和國藥典2015年版一部銀杏葉提取物總銀杏酸檢查項即以銀杏酸C13：0（白果新酸）的校正因子一測多評5種銀杏酸含量。但以LC-MS/MS法測定總銀杏酸含量，無法使用一測多評法，需使用標準品外標法定量。目前銀杏酸C15：0、C17：2對照品不易獲得，樣品中含量很低，且銀杏酸C17：2結(jié)構(gòu)中含2個雙鍵，順反異構(gòu)體較多，目前尚未研究透徹。且3種銀杏酸已占銀杏酸總量的94%以上，美國藥典即以該3種銀杏酸含量之和作為總銀杏酸含量，歐洲藥典以銀杏酸C17：1的校正因子一測多評3種銀杏酸含量。故本方法以外標法測定3種含量較高的銀杏酸（C13：0、C15：1、C17：1），足以表征銀杏酸總量。

3.2?流動相的選擇?比較1%冰醋酸溶液、0.1%冰醋酸溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%氨水）4種水相流動相對于銀杏酸質(zhì)譜響應的影響，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%氨水）為水相時，響應最高，但色譜保留和峰形均較差，易導致定量準確性差。1%冰醋酸溶液為水相時，色譜分離度、峰形均較好，且響應能夠滿足靈敏度需要。

銀杏酸C17：1結(jié)構(gòu)中有一個雙鍵，存在2種順反異構(gòu)體，未完全分離，峰形稍差。因本方法為測定銀杏酸總量，且中華人民共和國藥典HPLC法同樣未將該順反異構(gòu)體完全分離，故參照中華人民共和國藥典2010年版確定甲醇-1%冰醋酸溶液（90∶10）為流動相。

3.3?基質(zhì)效應?色譜中共餾出組分未對待測銀杏酸產(chǎn)生基質(zhì)效應;但樣品中存在部分保留極強殘留于色譜柱中的成分，與后續(xù)樣品共餾出產(chǎn)生基質(zhì)增強效應，可使銀杏酸C17：1增強3倍以上。因此待銀杏酸全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液（99∶1）充分清洗色譜峰至少10倍柱體積，避免基質(zhì)效應。

3.4?制劑采用固相萃取前處理的必要性?杏芎氯化鈉注射液處方中包括磷酸川芎嗪、銀杏葉提取物、氯化鈉。如直接進樣，磷酸川芎嗪含量過高，可能污染儀器，并產(chǎn)生基質(zhì)效應，而氯化鈉為非揮發(fā)性鹽，對儀器產(chǎn)生永久性傷害。另按處方量折算，需取樣1 000 mL，方可滿足檢測靈敏度要求。因此樣品必須經(jīng)富集純化后方能進樣測定。因銀杏酸在反相色譜中保留較強，故采用HLB固相萃取柱分離基質(zhì)與銀杏酸。

3.5?制劑與原料銀杏酸含量比較?通過測定3批銀杏葉提取物及對應批次的注射液，測定結(jié)果表明，制劑中總銀杏酸含量與對應批次的提取物含量基本一致，制劑工藝未影響總銀杏酸含量。見表8。因此，控制好原料中的銀杏酸含量對于本品安全性尤為重要，而銀杏葉提取物制法中的大孔吸附樹脂凈化是其中的關鍵步驟，必須加以嚴格控制。

參考文獻

[1]劉平平，潘蘇華.銀杏葉制劑中銀杏酚酸研究進展[J].中國中藥雜志，2012，37（3）：274-277.

[2]楊揚，周斌，趙文杰.銀杏葉史話：中藥/植物藥研究開發(fā)的典范[J].2016，47（15）：2579-2591.

[3]吳向陽，仰榴青，陳鈞.高效液相色譜法測定銀杏葉提取物及其制劑中銀杏酸的含量[J].藥學學報，2003，38（11）：846-849.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].1部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：416-417.

[5]United Sates Pharmacopeial Convention.United States Pharmacopoeia，41 Revision，Volume 3[S].Baltimore：United Book Press，2018：4460-4663.

[6]Ruwei W，Yuta K，Yu L，et al.HPLC quantification of all five ginkgolic acid derivatives in Ginkgo biloba Extracts using 13：0 ginkgolic acid as a single marker compound[J].Planta Med，2015，81：71-78.

[7]鄭云楓，闞宏飛，楊陽，等.復方銀杏葉制劑中總銀杏酸含量測定方法的優(yōu)化[J].中國現(xiàn)代中藥，2018，20（10）：1282-1287.

[8]馬海霞，楊廣安，譚琪明，等.銀杏達莫注射液中總銀杏酸HPLC檢測法的建立及其含量分析[J].遼寧化工，2017，46（12）：1229-1232.

[9]李蘭崇，尹志芳，楊宇強，等.幾種銀杏類制劑中銀杏酸的高效液相色譜法測定[J].中國實用醫(yī)藥，2015，10（1）：233-235.

[10]姚建標，方玲，王如偉，等.中國藥典和歐洲藥典銀杏葉提取物中銀杏酸限度檢測方法比較研究[J].藥物分析雜志，2012，32（11）：2055-2059.

[11]Yao X，Xue P，Yu DH，et al.Determination of ginkgolic acids in ginkgo leaves extract from different manufacturers by UPLC-MS/MS[J].ChinJExpTraditMedFormulae，2017，23（6）：174-179.

[12]Mei W，Jianping Z，Bharathi A，et al.High-resolution gas chromatography/mass spectrometry method for characterization and quantitative analysis of ginkgolic acids in Ginkgo biloba plants，extracts，and dietary supplements[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62：12103-12111.

[13]杜小弟，李俊升，郭麗萍，等.二維液相色譜法在線富集測定銀杏葉提取物中銀杏酸含量[J].分析測試學報，2018，37（6）：682-688.

[14]孫健，李麗敏，胡青，等.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定銀杏葉提取物及其制劑中銀杏酸[J].色譜，2016，34（2）：184-188.

[15]孫健，張雪怡，李麗敏，等.混合型固相萃取-UHPLC/MS/MS法測定銀杏酮酯滴丸中銀杏酸含量[J].藥學學報，2018，53（9）：1532-1535.