武姿含　蔣素容　陳芯儀　高音來(lái)　肖山峰　田浩梅　陳楚淘

〔摘要〕 目的 探討針刺大椎、百會(huì)、人中穴對(duì)內(nèi)皮抑素（Endostatin， ES）作用于大鼠腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)變化及影響，研究ES作用于腦保護(hù)的部分機(jī)制。方法 將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組各10只，其余30只大鼠參照Z(yǔ)eaLonga線(xiàn)拴法制作大腦中動(dòng)脈缺血模型，造模成功后再隨機(jī)分為模型組、依達(dá)拉奉組、針刺組，10只/組。正常組、假手術(shù)組、模型組僅捆綁，依達(dá)拉奉組以3 mg/kg（稀釋至1 mL）腹腔注射，針刺組行大椎、人中、百會(huì)穴針刺，每12 h行1次治療，6次后行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，再行Western Blot法檢測(cè)ES表達(dá)。結(jié)果 （1）神經(jīng)功能缺損評(píng)分對(duì)比：治療后，與正常組、假手術(shù)組比較，其余3組評(píng)分較高（P<0.01）;與模型組比較，依達(dá)拉奉組及針刺組評(píng)分下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;治療前后依達(dá)拉奉組及針刺組組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。（2）ES比較：治療后與正常組及假手術(shù)組比較，其余3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，依達(dá)拉奉組及針刺組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 大鼠腦缺血再灌注損傷后，針刺能使神經(jīng)功能缺損評(píng)分下降，并能在一定程度上減少缺血區(qū)域海馬組織ES的表達(dá)，達(dá)到減輕腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，促進(jìn)腦組織的修復(fù)。

〔關(guān)鍵詞〕 腦缺血再灌注;針刺;大椎穴;百會(huì)穴;人中穴;內(nèi)皮抑素

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R245? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.015

Effects of Acupuncture Dazhui （DU14）， Baihui （GV20）， Renzhong （GV26） on ES

Protein Expression after Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

WU Zihan， JIANG Surong， CHEN Xinyi， GAO Yinlai， XIAO Shanfeng， TIAN Haomei， CHEN Chutao*

（College of Acupuncture， Moxbustion and Massage， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the changes and effects of acupuncture Dazhui （DU14）， Baihui （GV20）， Renzhong （GV26） on the expression of Endostatin （ES） after cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the mechanism of ES on brain protection. Methods A total of 50 SD rats were randomly divided into the normal group and the sham operation group， with 10 rats in each group. The other 30 rats were used to establish cerebral ischemia model according to the ZeaLonga method. After successful modeling， they were divided into the model group， the edaravone group， and the acupuncture group， with 10 rats in each group. The normal group， the sham operation group and the model group were only bundled. The edaravone group was injected with 3mg/kg （diluted to 1 mL） by intraperitoneal injection. In the acupuncture group， acupuncture at Dazhui （DU14）， Baihui （GV20）， Renzhong （GV26） was performed for 1 time in every 12 h， and neurological function defect score was performed after 6 times， and then the expression of ES was detected by Western Blot. Results （1） Comparison of neurological defects scores between groups： After treatment， compared with the normal group， and the sham operation group， the scores of other 3 groups were higher. Compared with the model group， the scores of the edaravone group and the acupuncture group decreased. The differences were statistically significant （P<0.01）. Comparing among the groups before and after the treatment， the differences were statistically significant （P<0.01）. （2） Comparison of ES： After treatment， compared with the normal group and the sham operation group， the differences among the other 3 groups were statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， the difference between the edaravone group and the acupuncture group was statistically significant （P<0.05）. Conclusion After cerebral ischemia reperfusion injury in rats， acupuncture can reduce the score of nerve function defect and reduce the expression of ES in the hippocampus tissue in the ischemia area to a certain extent， so as to reduce the mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury and promote the repair of brain tissue.

〔Keywords〕 cerebral ischemia reperfusion; acupuncture; Dazhui （DU14）; Baihui （GV20）; Renzhong （GV26）; endothelial inhibition

缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）又名腦梗死，本病多由腦動(dòng)脈血管?chē)?yán)重的狹窄、痙攣或完全阻塞導(dǎo)致。發(fā)生缺血性腦卒中后，在一定時(shí)間內(nèi)，腦梗死區(qū)域獲得再次的血液灌流時(shí)，組織損傷非但沒(méi)有減輕或恢復(fù)反而進(jìn)行性加重，這種現(xiàn)象為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI）[1]。大腦中動(dòng)脈栓塞后，缺血半暗區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)明顯上升，如內(nèi)皮抑素（endostatin， ES）。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：穴位組ES蛋白磷酸化顯著下調(diào)至4%[2-5]，同時(shí)文獻(xiàn)顯示：ES是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑[6]，是最有效的血管生成抑制因子之一，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)，且能在bFGF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程中，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血管新生的各個(gè)環(huán)節(jié)[7]。ES能下調(diào)促血管形成基因的表達(dá)，上調(diào)抗血管形成基因的表達(dá)，雙向調(diào)節(jié)病理性血管發(fā)生。故本實(shí)驗(yàn)觀察針刺大椎、百會(huì)、人中（穴）72 h后鼠腦梗死區(qū)域海馬組織中蛋白的表達(dá)情況，從ES表達(dá)程度分析探討針刺對(duì)腦組織缺血損傷部分作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1? 動(dòng)物及分組

SD大鼠50只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量200～250 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002]。20 ℃環(huán)境下，常規(guī)進(jìn)食、飲水3 d并保持12 h的晝/夜循環(huán)之后，隨機(jī)分為正常組10只、假手術(shù)組10只，剩余30只造模成功后再隨機(jī)分成模型組、依達(dá)拉奉組、針刺組，10只/組。

1.2? 動(dòng)物模型建立及納入試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

需造模30只大鼠參照 Zea Longa方法[8]并加以改良制成局灶性腦缺血再灌注損傷模型。大鼠禁食、常規(guī)飲水24 h后，用10%的水合氯醛按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射，仰臥位在右側(cè)距前正中線(xiàn)0.3 cm處，切1 cm小口，用止血鉗行鈍性剝離皮下筋膜，暴露頸總動(dòng)脈（CCA）及分支頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA），分離以上動(dòng)脈及迷走神經(jīng)并掛線(xiàn)，于近心端結(jié)扎CCA與ECA，動(dòng)脈夾夾住ICA，在距CCA分支形成ICA、ECA分叉約3 mm處剪一小口，將尼龍線(xiàn)栓由CCA插入，松開(kāi)動(dòng)脈夾，到達(dá)19 mm時(shí)感到稍許阻擋，表明線(xiàn)栓頭側(cè)已到達(dá)大腦中動(dòng)脈，緊緊結(jié)扎ICA遠(yuǎn)心端細(xì)線(xiàn)后將傷口縫合，在皮膚上固定好線(xiàn)栓末端。缺血120 min后拔出1 cm左右線(xiàn)栓，造成再灌注模型。術(shù)后20 ℃環(huán)境下常規(guī)進(jìn)食、水及飼養(yǎng)。假手術(shù)組造成缺血狀態(tài)但不作再灌注，其余操作及步驟與造模組一致。待麻醉醒后，生命各體征穩(wěn)定，參照Z(yǔ)ea Lonnga五級(jí)5分標(biāo)準(zhǔn)[9]評(píng)分，評(píng)分為1～3分者入組，解剖后取腦可見(jiàn)梗塞區(qū)域在缺血顳葉皮質(zhì)，與大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域一致，提示模型成功。取腦時(shí)若有顯著的蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠則剔除試驗(yàn)。剔除不符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)者后，以同樣的造模方式進(jìn)行補(bǔ)齊。

1.3? 選穴及針刺方法

穴位選取參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》[10]及人體骨度分寸法。大椎：直刺0.5 cm;百會(huì)：平刺0.1 cm;人中：向鼻中隔方向斜刺0.2 cm。

1.4? 干預(yù)方法

正常組不做任何處理，其他組成功造模后待大鼠呼吸、心率等生命體征穩(wěn)定之后處理如下：假手術(shù)組與模型組動(dòng)物僅做綁扎，時(shí)間為0.5 h;依達(dá)拉奉組捆綁并腹腔注射3 mg/kg（稀釋至1 mL），時(shí)間為0.5 h;針刺組于綁扎后行針刺治療，每個(gè)穴位行針捻轉(zhuǎn)60 s，每15 min行針1次，留針0.5 h后松綁。各組大鼠每隔12 h行1次捆綁/治療，72 h后行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，再用10%水合氯醛麻醉并處死。

1.5? 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1? 神經(jīng)功能缺損評(píng)分? 神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照Z(yǔ)ea Longa 5分法[9]，將實(shí)驗(yàn)大鼠評(píng)分后，再行再灌注，待大鼠清醒后，完成治療對(duì)其再次做神經(jīng)功能缺損評(píng)分。具體如下：0分，無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀;1分，提尾時(shí)栓塞動(dòng)脈對(duì)側(cè)前肢不能伸直;2分，行走時(shí)向栓塞動(dòng)脈對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn);3分，行走時(shí)向栓塞動(dòng)脈對(duì)側(cè)傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.5.2? Western blot法檢測(cè)ES表達(dá)? 大鼠完成治療并腹腔麻醉致死后，斷頭后分離缺血區(qū)海馬的組織塊，冰NaCl10%沖洗后取5 mm×5 mm大小，固定于4%多聚甲醛24 h后石蠟包埋、切片。剪取0.025 g組織塊，冰預(yù)冷PBS洗組織，加入200 ？滋L RIPA裂解液于勻漿器中反復(fù)研磨組織直至看不見(jiàn)組織塊，冰上，蛋白裂解10 min，離心后分裝置于離心管中;測(cè)定蛋白濃度后電泳、轉(zhuǎn)膜后，用1×TBST配制的5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置90 min。一抗（Rabbit-bs-0547R）與膜共同孵育，4 °C過(guò)夜;二抗（HRP Proteintech-Rabbit）與膜共同孵育90 min，洗色后ECL顯色并曝光，顯影沖洗，底片掃描后用quantity one專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算結(jié)果。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用“x±s”表示;多組計(jì)量資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法，計(jì)數(shù)資料采用？字2檢驗(yàn)。不滿(mǎn)足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，用中位數(shù)和四分位間距[M（Q）]描述。

2 結(jié)果

2.1? 針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

治療后，各組大鼠大腦組織行切片后用TTC染色，紅色的染色區(qū)為正常組織區(qū)域，白色的染色區(qū)為梗死灶，正常組與假手術(shù)組未見(jiàn)梗死區(qū)，其余3組均有大小不同的梗死灶。治療前，與正常組及假手術(shù)組比較，其余3組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功。各組治療前后比較，依達(dá)拉奉組與針刺組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且依達(dá)拉奉組、針刺組低于模型組（P<0.01）。見(jiàn)圖1、表1。

2.2? 針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠海馬ES表達(dá)的影響

與正常組及假手術(shù)組比較，模型組、針刺組和依達(dá)拉奉組ES的表達(dá)程度均上升，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，針刺組、依達(dá)拉奉組ES的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與針刺組比較，依達(dá)拉奉組ES表達(dá)降低，但依達(dá)拉奉組與針刺組之間ES表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2，表2。

3 討論

ES可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在下調(diào)血管內(nèi)皮組織再生與增殖有著重要的作用。研究表明：大腦中動(dòng)脈栓塞后，缺血半暗區(qū)ES顯著上升，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[11]。針刺可抑制炎性反應(yīng)，抑制腦水腫形成，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)與血管再生等[12]，這與針刺能抑制促凋亡因子的表達(dá)有密切關(guān)系。丁玲[13]研究發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)、水溝、足三里可促進(jìn)MCAO大鼠內(nèi)血管新生，其作用機(jī)制可能與下調(diào)ES表達(dá)有關(guān)。同時(shí)針刺“百會(huì)”“大椎”穴可有效挽救半影區(qū)缺血神經(jīng)元，修復(fù)損傷神經(jīng)元，防止其發(fā)生壞死，促進(jìn)梗死灶周?chē)Ｉ窠?jīng)元出芽、再生，并形成新的突觸[14]。針刺可促進(jìn)腦缺血區(qū)血管新生，增加微血管密度，下調(diào)血管再生因子蛋白表達(dá)，其機(jī)制可能為通過(guò)多條通路對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白、增生與分化蛋白、周期蛋白進(jìn)行調(diào)控，抑制缺血腦組織細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血損傷腦組織的保護(hù)作用[15]。頭針可抑制ES表達(dá)[16-17]，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、降解血管基底膜，誘導(dǎo)心血管形成，加速周?chē)鷤?cè)枝循環(huán)的建立，從而減輕腦缺血損傷。電針能抑制MCAO大鼠腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞ES表達(dá)[18]，從而促進(jìn)血管再生，增加腦供血。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：腦缺血再灌注損傷后，大鼠神經(jīng)功能缺損的評(píng)分在針刺治療后降低（P<0.01），且針刺組治療后腦組織ES的表達(dá)降低（P<0.05），提示針刺能促進(jìn)ES的抑制生長(zhǎng)，使腦缺血再灌注損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，同時(shí)能明顯降低大鼠ES表達(dá)，降低腦缺血再灌注損傷風(fēng)險(xiǎn)。其效應(yīng)機(jī)制可能與通過(guò)針刺下調(diào)ES表達(dá)，促進(jìn)腦血管新生有關(guān)。針刺組與依達(dá)拉奉組ES的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明針刺治療與依達(dá)拉奉對(duì)CIRI后大鼠下達(dá)ES表達(dá)效應(yīng)相當(dāng)。由此推測(cè)，針刺大椎、百會(huì)、人中穴能更有效地下調(diào)CIRI大鼠大腦缺血側(cè)海馬ES的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦保護(hù)的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 涂雪松.缺血性腦卒中的流行病學(xué)研究[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2016，

24（5）：594-599.

[2] HAOMEI TIAN， HONG ZHANG， JUNBAO ZHU， et al. Acupuncture activates signal transduction pathways related to brain-tissue restoration after ischemic injury[J]. Nevral Regeneration Research， 2012，7（24）：1866-1872.

[3] 陳? 文，林亞平，楊茜云，等.針刺對(duì)腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNA數(shù)目的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（11）：61-64.

[4] 劉? 琴，林亞平，陳? 文，等.針刺聯(lián)合亞低溫對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織p-Raf1、p-ERK1/2的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（1）：58-62.

[5] 朱軍寶，劉步平，張? 泓，等.應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)篩選針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的凋亡相關(guān)蛋白[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2014，

42（3）：222-225.

[6] 李曉華.rAAV載體介導(dǎo)內(nèi)皮抑素抑制鼻咽癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[D].廣州：第一軍醫(yī)大學(xué)，2005.

[7] 丁? 玲，陳邦國(guó)，張曉明，等.電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織bFGF、ES表達(dá)的影響[J].光明中醫(yī)，2012，27（5）：879-881.

[8] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSON S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84-91.

[9] 李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：425-431.

[10] 華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（2）：209-213.

[11] 郭? 峰，王? 歡，馬賢德，等.眼針腦缺血再灌注模型大鼠腦組織VEGF，Ang-1及內(nèi)皮抑素表達(dá)的影響[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2011，

25（5）：22-23.

[12] 楊? 楊，孫? 華.近10年針刺治療腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)針灸，2015，35（7）：749-752.

[13] 丁? 玲.電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織bFGF、ES表達(dá)的影響[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[14] 許能貴，汪幗斌，佘世鋒，等.針刺百會(huì)、大椎穴對(duì)局灶性腦缺血大鼠皮層腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（6）：439-442.

[15] 楊? 敏，陳邦國(guó)，梁? 超.頭針對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織VEGF及ES表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23（6）：1012-1013.

[16] 張紅星，王? 瓊，周? 利，等.頭針抗大鼠急性腦缺血再灌注炎癥損傷的作用機(jī)制[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7（8）：769-774.

[17] 楊? 敏，陳邦國(guó)，梁? 超.頭針對(duì)大鼠局灶性缺血再灌注后腦組織VEGF及ES表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23（8）：1012-1013.

[18] 萬(wàn)秋霞，王威威，劉冬冬，等.電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后頸靜脈血糖及腦水腫的影響[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，

35（2）：39-42.