張進(jìn)忠 孫嘉曼 李朝生 韋莉萍 范燕萍

摘 要：該研究通過同源克隆技術(shù)克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、顆粒結(jié)合淀粉合酶（GBSS）和可溶性淀粉合酶（SSS）3類百合淀粉合成關(guān)鍵酶基因，分析這三類淀粉合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化，測定百合鱗莖膨大發(fā)育中淀粉含量變化。結(jié)果表明：（1）AGPase具有GlgC家族蛋白PLN02241蛋白結(jié)構(gòu)特征及cl11394家族蛋白ADP_Glucose_PP與NTP_transferase結(jié)構(gòu)域，獲登錄號KP751443;GBSS與SSS具有cl10013家族蛋白Glyco_transf_5，GT1_Glycogen_synthase_DULL1_like結(jié)構(gòu)域，獲登錄號分別為KP751444、KP751445。（2）百合鱗莖形成與膨大發(fā)育過程中，淀粉含量呈現(xiàn)遞增趨勢，鱗莖盤開始分化莖桿時其淀粉含量最高，達(dá)到44.52%。鱗莖與葉片部位的三個淀粉合成相關(guān)酶基因表達(dá)量均逐漸增加;在鱗莖膨大后莖桿分化階段，三個淀粉合成相關(guān)酶基因表達(dá)量達(dá)到最高，AGPase、GBSS、SSS在鱗片中的表達(dá)量分別為10.79，6.92和5.12，葉片中的表達(dá)量分別為6.79，5.22和4.41，鱗片中的表達(dá)量大幅度高于葉片;淀粉合成相關(guān)酶基因的表達(dá)量變化與淀粉含量、鱗莖的膨大發(fā)育成正相關(guān)。這為鱗莖的繁殖生產(chǎn)提供了可通過調(diào)節(jié)淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)促進(jìn)百合鱗莖膨大發(fā)育的思路。

關(guān)鍵詞：百合， 淀粉合成， 鱗莖膨大， 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶， 熒光定量PCR

中圖分類號：Q943.2， Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）04-0446-07

Abstract：The key enzyme genes of lily starch synthesis， ADP glucose pyrophosphorylase （AGPase）， granule binding starch synthase （GBSS） and soluble starch synthase （SSS）， were cloned by homologous cloning， and the bioinformatics analysis was performed. The bulblets and leaves of lilyduring the four stages of bulblet swellingdevelopment were used todetermine the starch content in bulblets atdifferent stages， and the expression of the key genes encoding starch synthesis-related enzymes in the process of bulblet swellingdevelopment were analyzed using fluorescence quantitative PCR. The results were as follows：（1） AGPase had PLN02241 proteindomain belonging to GlgC family protein and ADP_Glucose_PP and NTP_transferasedomain belonging to cl11394 family protein. The accession number of AGPase gene was KP751443. GBSS and SSS had Glyco_transf_5， GT1_Glycogen_synthase_DULL1_like conserveddomain belonging to cl10013 family protein. The accession numbers of GBSS and SSS genes were KP751445 and KP751444， respectively. （2） The starch content showed an increasing trend in the process of the formation anddevelopment of lily bulblet swelling. The starch content was up to 44.52% at the stemdifferentiation stage after bulblet swelling， which was the highest. The three starch synthesis-related genes were up-regulated gradually in bulblets and leaves. The expression of these three starch synthesis-related genes were up to the peak at the stemdifferentiation stage after bulblet swelling. The expression of AGPase， GBSS and SSS were 10.79， 6.92 and 5.12 in bulblet， and were 6.79， 5.22 and 4.41 in leaves， respectively. The genes expression were much higher in bulblets than in leaves. There was a positive correlation between the starch synthesis-related gene expression and the content of starch and bulblet swelling. The finding provides a reference for propagation production of lily bulblet， by which the expression of key synthesis-related genes can be regulated to promote the swellingdevelopment of lily bulblet.

Key words：Lilium， starch synthesis， bulblet swelling， AGPase， fluorescence quantitative PCR

百合（Lilium）是以鱗莖繁殖的一類植物，按用途可分為觀賞百合和藥食用百合。我國是藥食用百合的主產(chǎn)區(qū)，主要品種有蘭州百合、龍牙百合和卷丹百合等。生產(chǎn)上百合主要以鱗莖鱗片、莖生小鱗莖、珠芽等方式繁殖，其缺點(diǎn)是繁育周期長，需要完成基葉苗和莖桿苗后才能形成商品種球（趙健等，2017）。蘭州百合形成有莖苗需2～3 a，種植生產(chǎn)需3 a。因此，通過調(diào)控發(fā)育來誘導(dǎo)小鱗莖快速膨大，縮短生長周期，對于百合鱗莖種球生產(chǎn)具有重要意義。張進(jìn)忠等（2016）研究表明，淀粉合成積累促進(jìn)百合新生鱗莖膨大發(fā)育，而淀粉的合成代謝受多個基因調(diào)控，其中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成途徑的限速酶，參與淀粉合成的第一步反應(yīng)，而顆粒結(jié)合淀粉合酶（GBSS）和可溶性淀粉合酶（SSS）分別參與直鏈與支鏈淀粉的合成（王倩等，2017;安飛飛等，2018），影響作物品質(zhì)。這三類淀粉合成酶對于淀粉的合成具有重要作用，在百合中關(guān)于AGPase、GBSS和SSS基因的克隆及表達(dá)分析研究尚未見報道。

本研究擬克隆百合鱗莖淀粉合成相關(guān)酶基因，并針對鱗莖形成膨大發(fā)育不同階段，采用熒光定量PCR分析關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化，測定百合鱗莖膨大發(fā)育中淀粉含量變化，并結(jié)合淀粉含量的變化探索淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)模式，分析鱗莖種球發(fā)育過程中促使其膨大發(fā)育的機(jī)理。研究結(jié)果將為開發(fā)鱗莖膨大培育技術(shù)提供理論基礎(chǔ)，也為百合鱗莖種球生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：蘭州百合（Liliumdavidii var. unicolor）組培苗。根據(jù)組培過程中鱗莖發(fā)育進(jìn)程將其分為叢生芽階段，鱗莖形成階段，鱗莖膨大階段，鱗莖膨大后莖桿分化階段，分別標(biāo)記為A、B、C、D四階段。所取組織材料為各階段的鱗莖片與葉片材料（圖1），其中階段A鱗莖片材料取自形成鱗莖片的愈傷化組織，取鮮樣后液氮速凍置于-80 ℃冰箱保存。植物材料由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

主要試劑材料：RNA提取試劑Trizol購于Invitrogen;逆轉(zhuǎn)錄試劑RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于Fermentas;T載體pGEM-T購于Promega;DNA凝膠回收試劑盒AP-GX-50購于Axygen;質(zhì)粒抽提試劑盒AP-MN-P-50購于Axygen;M13 F引物：TGTAAAACGACGGCCAGT，M13 R引物：CAGGAAACAGCTATGACC，南京金斯瑞合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）購于TAKARA;熒光定量PCR儀：Bio-Rad iQ5。

1.2 方法

1.2.1 淀粉含量測定 取各發(fā)育階段鮮樣品，參照劉襄河等（2013）比色法進(jìn)行測定。

1.2.2 同源克隆淀粉合成關(guān)鍵酶基因cDNA序列 采用同源克隆的方法，根據(jù)已經(jīng)報道的其他作物AGPase、GBSS和SSS基因cDNA序列，首先分別尋找這三個基因的近緣物種完整開放閱讀框，然后在Blastn上根據(jù)此開放閱讀框進(jìn)行比對，將所有相關(guān)物種的開放閱讀框序列錄入， 使用MegAlign軟件進(jìn)行整體比對，選擇相似性最接近的區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，最終設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增出百合AGPase、GBSS和SSS基因的簡并引物（表1）。采用Trizol法提取各組織的RNA，用DNase I，

RNase-free去除RNA中的DNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA鏈;利用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠回收，將片段與pGEM-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)進(jìn)行陽性克隆篩選，再對陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取正確的克隆測序。

1.2.3 熒光定量PCR 利用軟件primer premier 5.0 （Premier Biosoft Interpairs， Palo Alto， CA）設(shè)計(jì)基因特異性引物，所用引物序列見表1。取不同發(fā)育階段（A、B、C和D）的鱗片與葉片組織，使用Trizol試劑盒抽提細(xì)胞RNA。使用PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成的cDNA用于目的基因表達(dá)分析，以18s rRNA作為內(nèi)參，用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增cDNA中的各目的基因片段和18s rRNA，反應(yīng)程序設(shè)置如下：95 ℃變性7 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算每個樣品目的基因和內(nèi)參的△Ct，并采用2-△△Ct法（Rajeevan et al.， 2001）計(jì)算各樣品中目的基因表達(dá)情況。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 百合鱗莖不同發(fā)育階段淀粉含量

百合組培鱗莖形成與膨大發(fā)育過程中，各階段淀粉含量呈現(xiàn)遞增規(guī)律，如表2所示，隨著鱗莖的膨大發(fā)育，其淀粉含量逐漸增加;鱗莖膨大后，鱗莖盤開始分化莖桿（D）時其淀粉含量最高，達(dá)到44.52%，表明鱗莖的膨大與其淀粉含量成正相關(guān)，其結(jié)果與張進(jìn)忠等（2016）的研究結(jié)果一致。

2.2 百合淀粉合成關(guān)鍵酶基因AGPase、SSS和GBSS的cDNA克隆

通過對近緣物種相關(guān)氨基酸序列Blast比對，尋找合適保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，分別擴(kuò)增AGPase、SSS和GBSS 百合淀粉合成相關(guān)酶基因的cDNA序列（圖2），分別測序得到918、567和1 257 bp的基因片段長度。經(jīng)過序列分析及比對，三條序列分別與淀粉合成關(guān)鍵酶基因AGP small subunit、SSSⅢ、GBSSⅠ同源性最高，分別達(dá)到100%、99%和 99%。將以上克隆序列上傳NCBI獲得基因登錄號：KP751443、KP751445、KP751444。將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列進(jìn)行Blast比對分析保守結(jié)構(gòu)域，由圖3可知，AGPase具有cl28238（GlgC）超級家族中PLN02241家族蛋白結(jié)構(gòu)特征及cl11394家族蛋白ADP_Glucose_PP與NTP_transferase結(jié)構(gòu)域;由圖4和圖5可知，GBSS與SSS具有cl10013家族蛋白Glyco_transf_5，GT1_Glycogen_synthase_DULL1_like結(jié)構(gòu)域。

2.3 淀粉合成酶關(guān)鍵基因在百合鱗莖不同發(fā)育階段的表達(dá)

最低，隨著鱗莖的膨大發(fā)育，各淀粉合成酶基因表達(dá)量逐漸增加，均在發(fā)育階段D達(dá)到最高。且此三基因在四個發(fā)育階段之間的表達(dá)量差異均達(dá)顯著水平（P<0.05），表達(dá)量最大的為階段D中編碼淀粉合成限速酶的AGPase基因，其表達(dá)量為10.79;分別為階段A、B、C的10.75、6.95、2.69倍;GBSS在階段D的表達(dá)量為6.92，分別為階段A、B、C的6.81、4.03、1.75倍;D階段的SSS表達(dá)量為5.12，分別為階段A、B、C的5.09、1.51、1.09倍。三基因的表達(dá)量變化與此四個階段鱗莖淀粉粒形成增多、淀粉含量逐漸遞增的表現(xiàn)相關(guān)。

圖7為鱗莖組培膨大發(fā)育過程中，葉片中各淀粉合成酶基因的表達(dá)情況。葉片中三淀粉合成酶基因表達(dá)量隨發(fā)育進(jìn)程而逐漸增加，并均于發(fā)育階段D達(dá)到最高。三基因在四個發(fā)育階段之間的表達(dá)量差異均達(dá)顯著水平（P<0.05），表達(dá)量最大的為階段D中AGPase基因，其表達(dá)量為6.79;同時，階段D中GBSS和SSS表達(dá)量分別達(dá)到5.22和4.41。階段D中AGPase的表達(dá)量為階段C、B、A的2.18、3.10、6.73倍;GBSS表達(dá)量為階段C、B、A的1.97、2.45、5.21倍;SSS表達(dá)量為階段C、B、A的1.74、2.77、4.40倍;這表明葉片中淀粉合成酶基因表達(dá)與鱗莖中表達(dá)變化一致。

3 討論與結(jié)論

百合是高淀粉作物，本研究觀察到，組培鱗莖的膨大發(fā)育涉及到其淀粉含量的急劇變化，鱗莖的膨大發(fā)育過程顯示了也是淀粉含量增加積累的過程（張進(jìn)忠等，2016），表明淀粉的合成代謝對于鱗莖種球膨大發(fā)育具有積極意義。對于百合鱗莖膨大研究已有相關(guān)報道，研究龍牙百合鱗莖膨大發(fā)育中，通過適當(dāng)濃度的外源調(diào)節(jié)劑蕓苔素內(nèi)酯處理可以提高鱗莖鮮重（仇碩等，2017）;毛百合組培中蔗糖、NAA、IBA、活性炭及多效唑?qū)υ嚬荀[莖形成和膨大都有影響，水楊酸對鱗莖膨大效果不明顯（張彥妮等，2016）;在蘭州百合組培效鱗莖膨大研究中，活性炭、蔗糖及多效唑?qū)[莖的膨大具有促進(jìn)作用（秦新惠等，2015）;珠芽是百合的一種繁育方式，為莖生小鱗莖，對百合腋生珠芽形成研究發(fā)現(xiàn)淀粉和糖代謝及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在珠芽形成中發(fā)揮了重要作用，淀粉的合成和積累可促進(jìn)卷丹珠芽的啟動（Yang et al.， 2017），可見淀粉合成代謝對鱗莖的形成具有積極意義。

在百合組培鱗莖發(fā)育過程中，通過外因誘導(dǎo)（蔗糖、植物生長調(diào)節(jié)劑）使鱗莖膨大發(fā)育，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)組培鱗莖膨大與淀粉粒的形成與淀粉含量增加存在正相關(guān)（Zhang et al.，2014）;利用實(shí)時熒光定量PCR對其主要淀粉合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行表達(dá)分析，以期了解在鱗莖組培發(fā)育過程中淀粉合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況，探索調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)理。在AGPase的時空表達(dá)中，結(jié)果顯示鱗莖種球形成、膨大發(fā)育與AGPase表達(dá)正相關(guān)，也與淀粉含量正相關(guān)（張進(jìn)忠，2016），在表達(dá)部位上其鱗莖與葉片都有表達(dá)，鱗莖高于葉片表達(dá)，且隨發(fā)育階段的時間變化，各表達(dá)量變化一致。GBSS、SSS對直鏈和支鏈淀粉合成起主要催化作用（苗紅霞等，2016），其表達(dá)模式與AGPase類似，它們以AGPase催化合成的產(chǎn)物為底物延長糖苷鏈;對AGPase基因的調(diào)控研究通常認(rèn)為其受激活因子3-PGA與抑制因子Pi調(diào)節(jié)（高振宇和黃大年，1998），本研究中所采用的不同發(fā)育階段材料分別為使用了不同濃度蔗糖、植物生長調(diào)節(jié)劑等外源因子后形成的，此促進(jìn)鱗莖膨大發(fā)育的過程與AGPase表達(dá)增強(qiáng)變化一致，可能存在所采用的外源因子正調(diào)控AGPase基因的表達(dá)模式，這對于百合的種球膨大生產(chǎn)具有積極意義，相關(guān)研究還需要進(jìn)一步開展。

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