鄭國成 周永妍 張巖巖 楊琴 姜國志 孫勝斌 劉鐵軍

中圖分類號 R921；R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0657-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.16

摘 要 目的：探討2015年版《中國藥典》（一部）（以下簡稱藥典）中板藍(lán)根【鑒別】（3）（R，S）-告依春薄層色譜（TLC）鑒別方法的合理性，并進(jìn)行方法改進(jìn)。方法：將3批板藍(lán)根藥材按藥典板藍(lán)根【炮制】方法制成飲片。首先按藥典板藍(lán)根【鑒別】（3）方法分別對板藍(lán)根飲片和藥材中（R，S）-告依春進(jìn)行TLC鑒別（樣品處理時以80%甲醇為溶劑，超聲提取），考察藥典方法的合理性。然后通過改變樣品的提取溶劑及前處理方式（方法一：以水為溶劑，超聲提取；方法二：先加水浸泡1 h，再加入甲醇超聲提?。环椒ㄈ合葘悠窛櫇?，晾干后再以80%甲醇為溶劑，超聲提取 ）進(jìn)行方法改進(jìn)，并對最優(yōu)方法進(jìn)行驗證。最后按最優(yōu)方法操作，分別采用不同廠家來源的色譜板，以及在低溫低濕（7 ℃，相對濕度48%）和高溫高濕（35 ℃，相對濕度75%）條件下進(jìn)行（R，S）-告依春的TLC鑒別，考察方法的耐用性。結(jié)果：按藥典方法進(jìn)行檢測，在飲片色譜中，與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，但在藥材色譜中無相應(yīng)斑點出現(xiàn)。按3種改進(jìn)方法對樣品進(jìn)行處理后，在藥材色譜中，與對照品色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點；但按方法一處理后色譜斑點單一，按方法二、三處理后色譜斑點均較多，且方法二較方法三耗時更短。驗證試驗結(jié)果和方法耐用性試驗結(jié)果均顯示，按方法二對板藍(lán)根藥材和飲片進(jìn)行處理后，在飲片和藥材色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點。結(jié)論：改進(jìn)后的TLC鑒別方法效果良好，色譜斑點清晰、重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞 2015年版《中國藥典》（一部）；板藍(lán)根；（R，S）-告依春；薄層色譜鑒別；方法改進(jìn)

Improvement of Identification Method （3） of Isatis indigotica from 2015 Edition of Chinese Pharmacopeia （PartⅠ）

ZHENG Guocheng1，ZHOU Yongyan1，2，ZHANG Yanyan1，2，YANG Qin1，JIANG Guozhi1，2，SUN Shengbin1，2，LIU Tiejun1，2（1.Shineway Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Shijiazhuang 051430， China；2.Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology Research Center， Shijiazhuang 051430， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the rationality of TLC identification method （3） of （R，S）-epigoitrin in Isatis indigotica stated in 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （partⅠ） （later abbreviated as pharmacopeia）， and make some improvements. METHODS： Three batches I. indigotica were collected and prepared into decoction pieces according to the processing method of I. indigotica in pharmacopoeia. TLC identification of （R，S）-goitrin in I. indigotica decoction piece and medicinal material were conducted according to identification method （3） in pharmacopeia （80% ethanol as solvent for sample treatment， ultrasound extraction）； the rationality of pharmacopoeia method was investigated. Then the method was improved by changing the extraction solvent and pretreatment method （method one： using water as solvent， ultrasound extraction； method two： soaking in water for 1 h， then adding into methanol， ultrasound extraction； method three： the sample was wetted and then dried， using 80% methanol as solvent， ultrasound extraction） of samples， and the optimal method was verified. According to the optimal method， the TLC identification of （R，S）-goitrin was detected by using chromatographic plates from different manufacturers， under the conditions of low temperature and low humidity （7 ℃， relative humidity 48%） and high temperature and high humidity （35 ℃， relative humidity 75%） respectively，to investigate the durability of the method. RESULTS： According to the method of pharmacopeia， in the chromatograms of decoction pieces， the same color spots appeared at the corresponding chromatographic positions of reference substance， but no corresponding spots appeared in the medicinal material chromatograms. After the samples were treated by three improvement methods， in medicinal material chromatograms， the same color spots appeared in the corresponding chromatographic positions of reference substances. There were single chromatographic spot after medicinal materials were treated with method one， and there were more spots after medicinal materials were treated with method two and three， and method two consumed less time than method three. The results of validation tests and method durability tests showed that after the treatment of I. indigotica and its decoction pieces according to method two， the same color spots appeared in the corresponding positions of the decoction pieces and the medicinal materials chromatograms as those of the control. CONCLUSIONS： The improved TLC identification method is effective， the chromatographic spots are clear， and the repeatability is good.

KEYWORDS 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅰ）； Isatis indigotica；（R，S）-goitrin； TLC identification； Method improvement

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，臨床上可用于上呼吸道感染、扁桃腺感染和流行性乙型肝炎以及肺炎等的治療，是常用的中藥材，全國各地均產(chǎn)[1-6]。自1985年版《中國藥典》（一部）開始收錄板藍(lán)根后[7]，至今為止其在各版藥典中均有收錄，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷完善和提高。

（R，S）-告依春又名表告依春，是板藍(lán)根中主要生物堿，具有較強(qiáng)的抗病毒活性，而且含量穩(wěn)定，常作為板藍(lán)根藥材及相關(guān)制劑的含量控制指標(biāo)[8-12]。在2010年版《中國藥典》（一部）板藍(lán)根項下新增了【鑒別】（3）（R，S）-告依春的薄層色譜（TLC）鑒別[13]，并繼續(xù)收載于2015年版《中國藥典》（一部）（以下簡稱藥典）中[1]。但筆者在實際操作中發(fā)現(xiàn)，按藥典板藍(lán)根【鑒別】（3）方法鑒別時，板藍(lán)根藥材中（R，S）-告依春鑒別結(jié)果不呈陽性，并有相關(guān)文獻(xiàn)佐證[14-15]。故本研究通過探討供試品處理方法，確定影響因素，改進(jìn)板藍(lán)根藥材（R，S）-告依春的TLC鑒別方法，以期為新版藥典中板藍(lán)根藥材（R，S）-告依春的TLC鑒別方法的修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CPA225D型電子分析天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；KH3200E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；RHP-200型高速多功能粉碎機(jī)（永康市榮浩工貿(mào)有限公司）；HH-2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；REPROSTAR 3型薄層色譜數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）。

1.2 藥品與試劑

3批板藍(lán)根藥材均采自甘肅民樂（批號：分別為1704012、1704013、1704014），經(jīng)原河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任中藥師鑒定均為正品；（R，S）-告依春對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111753-201706，純度：100.0%）；試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 其他

藥典檢驗篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）；硅膠GF254板分別購自德國默克公司（批號：HC4317- 0054）、青島海洋化工有限公司（批號：015010）和煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗廠（批號：20101007）。

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根飲片的制備

將上述3批板藍(lán)根藥材按照藥典板藍(lán)根飲片【炮制】項下方法——“除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥?！狈謩e制備成相應(yīng)3批藥材飲片（批號：分別為1706181、1706182、1706183）。

2.2 （R，S）-告依春TLC鑒別的藥典方法

2.2.1 供試品溶液的制備 取板藍(lán)根藥材和飲片粉末各1 g，分別加入80%甲醇20 mL，超聲（頻率：30 kHz、功率：250 W，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 ?。≧，S）-告依春對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg（R，S）-告依春對照品的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 TLC鑒別條件及結(jié)果 吸取“2.2.1”“2.2.2”項下3種溶液各5～10 μL，分別點樣于同一硅膠GF254薄層板上（德國默克板），以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。置于紫外光燈（波長254 nm）下檢視，TLC圖見圖1。

由圖1可見，按照藥典方法檢驗，在3批板藍(lán)根飲片供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點，結(jié)果呈陽性。但在3批板藍(lán)根藥材供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上均無相同顏色的斑點出現(xiàn)，結(jié)果不呈陽性。

2.3 對藥典方法的改進(jìn)

對“2.2”項下結(jié)果分析推斷，板藍(lán)根藥材炮制過程可能對（R，S）-告依春鑒別結(jié)果產(chǎn)生影響，且（R，S）-告依春為水溶性成分。因此，本研究通過嘗試改變板藍(lán)根藥材的提取溶劑及前處理方法，以期達(dá)到鑒別結(jié)果呈陽性的目的。

2.3.1 供試品溶液的制備 按改進(jìn)方法一：取板藍(lán)根藥材（批號：1704012）粉末1 g，加水20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液一。按改進(jìn)方法二：取板藍(lán)根藥材（批號：1704012）粉末1 g，加水4 mL，浸泡1 h，再加甲醇16 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液二。按改進(jìn)方法三：取板藍(lán)根藥材粉末（批號：1704012）適量，加少量水全部潤濕，攤開，常溫晾干（藥材潤濕和晾干后樣品見圖2），再取晾干后粉末1 g，加80%甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液三。

2.3.2 對照品溶液的制備 取（R，S）-告依春對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備對照品溶液。

2.3.3 TLC鑒別條件及結(jié)果 分別取對照品溶液、按藥典方法制備的藥材供試品溶液以及按3種改進(jìn)方法制備的藥材供試品溶液一、二、三，按“2.2.3”項下色譜條件及操作方法進(jìn)行鑒別，TLC圖見圖3。

由圖3可見，在按3種改進(jìn)方法制備的藥材供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的斑點，結(jié)果均呈陽性。供試品溶液一（點2）用水提取所得的色譜圖斑點單一，只有（R，S）-告依春一個斑點，鑒別意義不大；且藥材加水超聲處理后，過濾蒸干，蒸干過程較慢，再用甲醇溶解過程較困難，且所得供試品溶液渾濁，需靜置后取上清液點樣。在供試品溶液二（點5）及供試品溶液三（點8）藥材供試品色譜圖中，斑點較多；但供試品溶液三藥材潤濕后再干燥，處理過程時間較長，而供試品溶液二樣品處理方法較簡便，且溶液澄清、易點樣。因此，在以上3種改進(jìn)方法中，優(yōu)選改進(jìn)方法二作為板藍(lán)根中（R，S）-告依春TLC鑒別的供試品前處理方法。

2.4 改進(jìn)方法二的驗證試驗

2.4.1 供試品溶液的制備 分別取3批板藍(lán)根藥材粉末（批號：分別為1704012、1704013、1704014）和飲片粉末（批號：分別為1706181、1706182、1706183）1 g，加水4 mL，浸泡1 h，再加甲醇16 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.4.2 對照品溶液的制備 取（R，S）-告依春對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備對照品溶液。

2.4.3 TLC鑒別條件及結(jié)果 分別取“2.4.1”項下供試品溶液和“2.4.2”項下對照品溶液各5～10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件及操作方法進(jìn)行（R，S）-告依春的TLC鑒別，TLC圖見圖4。

由圖4可見，按改進(jìn)方法二進(jìn)行檢驗，在3批藥材及其對應(yīng)3批飲片供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點，結(jié)果均呈陽性。

2.5 方法耐用性試驗

按“2.4.1”項下方法制備對照品溶液和板藍(lán)根藥材和飲片的供試品溶液，采用另外兩種不同來源的色譜板（山東煙臺板和青島海洋板）在常溫常濕（25 ℃、相對濕度48%）條件下，以及在低溫低濕（7 ℃，相對濕度30%）和高溫高濕（35 ℃，相對濕度75%）條件下（此時均用默克板）分別按“2.2.3”項下色譜條件及操作方法進(jìn)行（R，S）-告依春的TLC鑒別，考察方法耐用性，TLC圖見圖5。

由圖5可見，采用不同來源色譜板以及在不同溫度和濕度條件下，在藥材和飲片供試品圖譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點，結(jié)果均呈陽性。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，按照藥典方法進(jìn)行檢驗，3批板藍(lán)根藥材檢驗結(jié)果均不呈陽性，但對應(yīng)的3批飲片結(jié)果均呈陽性。據(jù)文獻(xiàn)報道，（R，S）-告依春是一種水溶性成分[16]，而且藥典板藍(lán)根項下（R，S）-告依春含量測定的供試品溶液也為加水煎煮制得[1]。分析原因，筆者猜測可能是因為飲片經(jīng)過了“洗凈，潤透，切厚片，干燥”的炮制過程，在飲片炮制的潤透過程中（R，S）-告依春溶解于水中，在干燥過程中隨水分往飲片表面遷移，水分干燥后，（R，S）-告依春附著于飲片表面，故而在TLC鑒別供試品處理時可更好地溶解于80%甲醇中，因此飲片鑒別呈陽性；而藥材并未進(jìn)行上述處理，故在鑒別時不呈陽性。

為驗證上述推論是否合理，筆者嘗試了3種不同的供試品處理改進(jìn)方法，改進(jìn)方法一直接將提取溶劑改為水；改進(jìn)方法二、三則均先用水將（R，S）-告依春浸出，然后再用相應(yīng)醇溶液提取。結(jié)果顯示，按上述3種改進(jìn)方法進(jìn)行樣品處理后檢驗，板藍(lán)根藥材和飲片的鑒別結(jié)果均呈陽性。因此，可驗證上述推論正確。通過綜合比對在3種改進(jìn)方法中樣品的處理及點樣的難易程度，優(yōu)選改進(jìn)方法二作為板藍(lán)根中（R，S）-告依春TLC鑒別的供試品處理方法。

上述研究結(jié)果表明，方法改進(jìn)后所得板藍(lán)根藥材和飲片色譜結(jié)果均呈陽性，且經(jīng)過耐用性考察能適應(yīng)不同廠家生產(chǎn)的預(yù)制薄層板及手鋪板，較藥典收載方法更可取。

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（收稿日期：2018-11-29 修回日期：2019-01-06）

（編輯：林 靜）