何志清 漏佳偉 徐佳煬

摘要：甾體類藥物在臨床應(yīng)用比較廣泛，僅次于抗生素類藥物，而這些不同結(jié)構(gòu)的甾體藥物分子結(jié)構(gòu)都是通過(guò)甾體激素中間體衍生的。甾體激素中間體傳統(tǒng)生產(chǎn)方式中包括化學(xué)合成和植物提取皂素法，這兩種生產(chǎn)方式不僅反應(yīng)結(jié)構(gòu)單一，需要消耗的成本高，同時(shí)還會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。所以必須要對(duì)甾體激素中間體的生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行研究，本文主要以合成生物技術(shù)為例對(duì)生產(chǎn)甾體激素中間體的方式進(jìn)行解讀，并對(duì)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：合成生物技術(shù);甾體激素中間體;研究

甾體類藥物是一種含有環(huán)戊烷多氫菲母核結(jié)構(gòu)的激素類藥物，比如常見(jiàn)的倍他米松、地塞米松等。甾體類藥物與抗生素是二十世紀(jì)藥物工業(yè)發(fā)展中的兩大突破，對(duì)治療呼吸系統(tǒng)、腫瘤以及內(nèi)分泌等方面的疾病具有重要的作用。甾體類藥物每年的銷售量大，達(dá)到世界醫(yī)藥產(chǎn)品總額的10%。甾體類藥物生產(chǎn)中甾體激素中間體是一種應(yīng)用比較廣泛的藥物形式，具有非常強(qiáng)大的市場(chǎng)需求，但是傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中成本高、產(chǎn)品單一以及生產(chǎn)污染等問(wèn)題導(dǎo)致甾體類藥物的發(fā)展受到限制，所以還需要加強(qiáng)對(duì)甾體激素中間體生產(chǎn)技術(shù)的完善。

一、合成生物技術(shù)在甾體激素類中間體生產(chǎn)的解讀

（一）異戊二烯下游藥物生產(chǎn)

合成生物是以工程學(xué)思維為基礎(chǔ)的，設(shè)計(jì)和構(gòu)建的新生物模塊、元件、系統(tǒng)或者一種天然系統(tǒng)的具有新功能、用途的，能夠滿足人類發(fā)展要求的生物技術(shù)。合成生物技術(shù)當(dāng)前已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到能源、環(huán)境和醫(yī)藥中，并取得了突破性的發(fā)展。當(dāng)前已經(jīng)出現(xiàn)多種細(xì)胞異戊二烯基礎(chǔ)上的下游藥物生產(chǎn)模式。將異戊二烯焦磷酸作為前體分子，并通過(guò)聚合、降解以及修飾等方式合成多種萜烯類藥物，比如丹參酮、青蒿素、人參皂苷等，或者甾體激素類藥物，比如黃體酮。

在青蒿素的生產(chǎn)中以美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的Jay教授為領(lǐng)軍人物。Jay教授在2003年首次通過(guò)大腸桿菌表達(dá)青蒿素的克隆基因，并獲得青蒿二烯。2006年課題組又通過(guò)酵母素對(duì)青蒿二烯合成酶的基因進(jìn)行導(dǎo)入，并通過(guò)P450氧化酶實(shí)現(xiàn)酶基因的還原，生產(chǎn)青蒿酸。2008年開(kāi)始加強(qiáng)對(duì)青蒿酸酵母菌的優(yōu)化，通過(guò)發(fā)酵后獲得青蒿酸。以此為基礎(chǔ)，課題組還研究了人工蛋白支架，使大腸桿菌中不同的反應(yīng)酶和分子數(shù)進(jìn)行捆綁，通過(guò)協(xié)同作用對(duì)中間代謝物的積累進(jìn)行有效的控制，提升產(chǎn)物的合成效率[1]。2009年通過(guò)基因來(lái)源的選擇替代工業(yè)發(fā)酵，提升青蒿二烯的生產(chǎn)效率。2013年又引入了5個(gè)外援反應(yīng)酶以及輔助蛋白模塊，進(jìn)一步提升青蒿酸的產(chǎn)量。

丹參酮是一種中藥提取物，具有良好的抗腫瘤作用，近年來(lái)得到廣泛的關(guān)注。2012年 科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所以釀酒酵母為底盤細(xì)胞，構(gòu)建模塊。通過(guò)表達(dá)tHMG1，以及BST1＼ERG20等，再一次提升丹參酮二烯的產(chǎn)量，同時(shí)通過(guò)發(fā)酵罐培養(yǎng)酵母工程菌，使產(chǎn)量翻番十幾倍。植物藥源在提取的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致物種資源破壞以及高污染等情況，形成嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題，所以還需要加強(qiáng)對(duì)新功能元件合成生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)和研究，逐漸由傳統(tǒng)天然提取的生產(chǎn)方式向微生物合成的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)變。

（二）甾體激素中間體底盤細(xì)胞的構(gòu)建

人體以及動(dòng)物體內(nèi)的甾體激素分子主要的來(lái)源為膽固醇的合成，在膽固醇合成過(guò)程中中鯊烯到酵母固醇以及酵母中路徑一致，同時(shí)后期生產(chǎn)中酶的作用也基本相似，只有在末端生產(chǎn)過(guò)程中轉(zhuǎn)化為膽固醇或者麥角固醇。而釀酒酵母是代謝工程、基因工程等方面比較常用的一種菌株，操作更便捷，有利于大規(guī)模的培養(yǎng)和發(fā)酵，同時(shí)遺傳背景比較清晰，次生代謝產(chǎn)物單一，代謝的產(chǎn)物可以純化，實(shí)現(xiàn)核心蛋白的理想表達(dá)。所以最為固醇類的底盤細(xì)胞具有非常強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[2]。

德國(guó)柏林工業(yè)大學(xué)課題組對(duì)尿就酵母內(nèi)源固醇生物合成途徑中涉及到的基因調(diào)控進(jìn)行研究，并對(duì)tHMGR基因進(jìn)行上調(diào)，提升酵母固醇前體物角鯊烯的產(chǎn)量。促進(jìn)角鯊烯的固醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，該課題組還對(duì)羊毛固醇C-14去甲基化醇酶基因以及角鯊烯環(huán)氧酶基因進(jìn)行表達(dá)，提升下游總固醇的產(chǎn)量。

（三）甾體激素中間體元件挖掘和檢驗(yàn)構(gòu)建

釀酒酵母底盤系統(tǒng)通過(guò)改造和優(yōu)化后，合成了分子類似物的外源膽固醇能力，通過(guò)人工路徑的設(shè)計(jì)，進(jìn)一步合成甾體類分析。動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)對(duì)膽固醇側(cè)鏈的降解，剩余一個(gè)酮基反應(yīng)，再通過(guò)細(xì)胞蘇媚以及蛋白鐵氧化與鐵氧還蛋白還原酶ADR合成。2009年該研究組通過(guò)HIP-CoA轉(zhuǎn)移酶基因與HIL-CoA脫氫酶基因失活反應(yīng)，得到ADD、AD等重要的甾體中間體。并為其他微生物對(duì)甾體激素中間體的合成提供有效的思路，實(shí)現(xiàn)甾體激素藥物中間體工藝的多元化發(fā)展，對(duì)我國(guó)甾體植物源天然產(chǎn)物資源的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有重要的意義。

二、合成生物技術(shù)在甾體激素中間體生產(chǎn)的應(yīng)用展望

通過(guò)對(duì)基因原件包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子等根據(jù)工程化目標(biāo)要求進(jìn)行連接和重組就可以形成一個(gè)功能基因模塊。再通過(guò)對(duì)已有的生物網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用以及新功能基因模塊的引入等無(wú)法表達(dá)天然細(xì)胞合成，或者合成的產(chǎn)物量過(guò)低。雖然合成生物技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)新的方式和途徑，但是仍然處于初步的發(fā)展階段，生物合成路徑較長(zhǎng)的物質(zhì)酶反應(yīng)還存在一定的不足，容易限制反應(yīng)的發(fā)展，所以必須要對(duì)合成路徑進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，提升合成產(chǎn)量。

在甾體激素中間體的生產(chǎn)中通過(guò)合成生物技術(shù)的應(yīng)用中最常見(jiàn)的底盤細(xì)胞為釀酒酵母，同時(shí)內(nèi)源固醇是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)合成的底物細(xì)胞，對(duì)代謝路徑的控制嚴(yán)格，但是通過(guò)對(duì)內(nèi)源途徑的控制和改進(jìn)仍然可以提升固醇含量的空間。此外，在固醇類代謝中脂肪酸合成是重要的途徑和方式，同時(shí)應(yīng)用的前體主要為乙酰輔酶A，所以需要加強(qiáng)對(duì)乙酰輔酶A積累向內(nèi)源固醇的轉(zhuǎn)化，而向脂肪酸的轉(zhuǎn)化，通過(guò)對(duì)這兩條代謝途徑的協(xié)調(diào)，為合成生物技術(shù)生產(chǎn)甾體激素中間體研究提供了重要的指導(dǎo)方向。

結(jié)語(yǔ)：

綜上所述，甾體激素中間體是甾體類藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵原料，但是傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式中，由于產(chǎn)量低、成本高、污染嚴(yán)重等原因?qū)е络摅w類藥物生產(chǎn)受到嚴(yán)重的限制，所以還需要加強(qiáng)對(duì)合成生物技術(shù)的研究，提升甾體激素中間體的產(chǎn)量和效率，并降低成本，減少或者消除污染。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉奪，張瑩，周曉，等.合成生物技術(shù)生產(chǎn)甾體激素中間體的研究展望[J].生命科學(xué)，2013，25（10）：958-965.

[2]邵明龍，張顯，徐美娟，等.全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成甾體激素類藥物中間體的研究[C].中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第十屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨2016年全國(guó)生物技術(shù)大會(huì)論文集.江南大學(xué)，2016：1-3.