鄭雪蓮 李嘉儀 楊俊

摘 要：以解放鐘枇杷為材料，分析果實發(fā)育過程中黃酮醇合成酶（Flavonol Synthase，F(xiàn)LS）基因表達(dá)與黃酮醇積累的相關(guān)性，進(jìn)而探討枇杷果實黃酮醇積累的分子機(jī)制。利用高效液相色譜法（HPLC）對不同時期枇杷果實黃酮醇含量進(jìn)行測定，通過RT-qPCR技術(shù)檢測了不同發(fā)育時期果實黃酮醇合成酶FLS基因的表達(dá)量。結(jié)果表明：枇杷果實中以黃酮醇含量最高，其次是二氫黃酮醇。黃酮醇含量在成熟過程中總體呈現(xiàn)下降趨勢，特別在果實發(fā)育前期（花后55～65 d）其含量下降幅度較大;而二氫黃酮醇含量呈上升趨勢，黃酮醇合成酶FLS基因的表達(dá)量變化與黃酮醇含量變化趨勢相似。枇杷果實不同時期的黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量與黃酮醇含量呈顯著正相關(guān)，但與二氫黃酮醇含量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明黃酮醇合成酶FLS基因?qū)﹁凌斯麑嶞S酮醇的合成具有明顯的正調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：枇杷; 黃酮醇; 黃酮醇合成酶基因; 基因表達(dá)量

Abstract： With Jiefangzhong loquat as material， the correlation between flavonol synthetase （FLS） genetic expression and flavonol accumulation during fruit development was analyzed in this paper， and then the molecular mechanism of flavonol accumulation in loquat fruits was discussed. High Performance Liquid （HPLC） was used to determine the content of flavonol in loquat fruits at different stages， and the expression level of FLS gene in fruits at different development stages was detected by using RT-PCR. The results showed that the content of flavonol was the highest in loquat fruits， followed by that of flavanonol. And the content of flavonol has tended to decrease on the whole in the ripening process， which was reducing greatly especially in the early stage of fruit development （55-65 d after anthesis）. However， the content of flavanonol was on the rise， and the change trend of the expression level of FLS gene was similar to that of flavanol. The expression level of FLS gene in loquat fruits at different stages had significant positive correlation with the content of flavonol， while it had significant negative correlation with the content of flavanonol， indicating that FLS gene had a significant positive regulating effect on the synthesis of flavonol in loquat fruits.

Key words： Loquat; Flavonol; Flavonol synthase gene; Expression level of gene

枇杷Eriobotrya japonica是薔薇科亞熱帶常綠果樹，原產(chǎn)于我國東南部，被廣泛種植在日本、意大利、巴基斯坦、西班牙等30多個國家。我國枇杷栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，年產(chǎn)量高達(dá)106 t，位居世界第1。我國枇杷主栽區(qū)域為東南沿海地區(qū)、華中地區(qū)、西南高原地區(qū)和華南沿海地區(qū)。特別在東南沿海地區(qū)（福建?。凌艘殉蔀楫?dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)特色水果。枇杷果實色澤風(fēng)味俱佳，且具有較高的藥用價值，其果實中起主要藥用作用的物質(zhì)為類黃酮，類黃酮是自然界中一類重要的天然次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化與自由基消除活性作用，抗腫瘤及抗癌作用，抗心血管疾病的作用，對酒精中毒的解毒作用和治療酒依賴作用[1]。類黃酮可分為黃酮醇類、黃酮類、查爾酮類、花青素類、黃烷酮類和異黃酮類等六大類，其中黃酮醇類含量占比最多，黃酮醇具有其他類黃酮化合物所具有的所有藥用功能[2-3]。枇杷果肉富含黃酮醇，其果肉中起主要藥用作用蘆丁、槲皮素等都屬于黃酮醇類。枇杷作為新的黃酮醇植物資源具有重要的研究價值和巨大的開發(fā)潛力。因此，研究黃酮醇合成酶FLS在枇杷果實黃酮醇積累中的作用，有利于揭示枇杷果實中大量積累黃酮醇的生化機(jī)理，為枇杷黃酮醇的開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

前人通過對苦蕎麥Fagopyrum tataricurn[4]、煙草Nicotiana tabacun[5]、茶樹Camellia sinensis[6]、金銀花Lonicera iaponica[7]等多種植物的研究，對黃酮醇生物合成途徑及參與其中多種酶類的作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮醇的合成需要多種酶的共同作用，其中起關(guān)鍵調(diào)控作用的為黃酮醇合成酶FLS[8]。生物合成黃酮醇大體可以分為3個階段，第1階段是苯丙烷代謝途徑，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，這種氨消除反應(yīng)是由生物體內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化[9]。反式肉桂酸在肉桂酸4羥化酶（C4H） 的催化下形成反式4香豆酸。反式4

香豆酸在香豆酸輔酶A連接酶（4CL）的催化下，生成產(chǎn)物香豆酰輔酶A，香豆酰輔酶A被活化后在查爾酮合酶（CHS）的作用下轉(zhuǎn)化為查爾酮，開啟了類黃酮物質(zhì)的合成代謝。第2階段，查爾酮異構(gòu)酶（CHI）催化查爾酮轉(zhuǎn)變成無色的黃烷酮，進(jìn)而衍生出該途徑中所有的類黃酮化合物[10]。黃烷酮經(jīng)過黃烷酮羥基化酶（F3H）催化生成二氫黃酮醇，二氫黃酮醇是花青苷與黃酮醇共用的底物。第3階段，二氫黃酮醇在黃酮醇合成酶FLS的催化下合成黃酮醇[11-15]。目前對枇杷類黃酮的研究大部分是針對葉[16]和花[17]，未見枇杷果實中與類黃酮物質(zhì)相關(guān)的研究報道。目前，枇杷果實黃酮醇合成積累的模式和機(jī)理尚不明確，其中黃酮醇合成酶FLS作為黃酮醇合成途徑的重要酶類之一，對枇杷果實中黃酮醇的積累起到不可缺少的作用。本研究以福建省主栽枇杷品種解放鐘為試驗材料，分析黃酮醇合成酶FLS基因?qū)S酮醇合成積累的機(jī)制進(jìn)行研究，為探討枇杷果實發(fā)育過程中黃酮醇積累的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品 所取試材為福建省莆田市常太鎮(zhèn)果園提供的解放鐘枇杷，于花后55、65、95、125 d 4個時期各采1次果，選擇管理水平和生長勢大致相同的3株枇杷樹，從每株樹上采6個果實，取樣后果實立即用雙蒸水洗凈，去除果皮，切取果實中部果肉10.00 g，稱取后的樣品用液氮迅速冷凍，置-80℃超低溫冰箱保存待測定。

1.1.2 引物序列設(shè)計及合成 從枇杷果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（未公布）中挑選所需基因的CDS序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）進(jìn)行Blast分析，選擇相似度較高的序列，初步篩選所需基因序列，使用primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，并由鉑尚生物公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 類黃酮物質(zhì)含量測定 類黃酮含量測定參照吳宏偉等[18]的方法，略有改動。取0.3 g鮮樣于液氮中研磨，并加入2 mL DMSO甲醇（1∶1），超聲15 min，取上清液10000 r·min-1，4℃離心10 min后分出上清液，取上清液，重復(fù)提取3次。合并上清轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中。取1 mL提取液過0.22 uL的有機(jī)濾膜，所得濾液用無水乙醇稀釋至10 mL，搖勻，備用。每個樣品設(shè)3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。精密稱取類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品分別置于10 mL量瓶中，加無水乙醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻;再分別精密吸取類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品1 mL置于10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，備用。色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 um）;流動相∶乙腈∶水∶冰醋酸為500∶500∶1;流速1 mL·min-1;柱溫25℃;檢測波長347 nm。依照上述色譜條件分別精密吸取對照品和供試品各10 uL，分別進(jìn)樣。

1.2.2 枇杷果實總RNA的提取 由于枇杷果肉中多糖多酚及水分含量較高，因此在提取過程中參照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明書稍有改動。RNA的完整性、純度和濃度是衡量RNA質(zhì)量的指標(biāo)。用超微量分光光度計對所提RNA濃度和純度進(jìn)行測定，并用1.0%瓊脂凝膠電泳對枇杷果實總RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄的操作方法 嚴(yán)格參照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 實時熒光定量PCR 從枇杷果實的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中挑選出黃酮醇合成酶FLS基因序列，采用Beacon Designer 7引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計。使用耶拿qTOWER2.2熒光定量儀完成定量分析。反應(yīng)參數(shù)為95℃ 30 s，1個循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 20 s，45個循環(huán)，每個樣品設(shè)3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，利用2ΔΔCT對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性和線性回歸等統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷果實總RNA的提取

2.2 枇杷果實發(fā)育過程中黃酮類物質(zhì)含量的動態(tài)變化

以花后55、65、95、125 d 4個采樣時期的枇杷果實為試材，利用HPLC對枇杷果實二氫黃酮醇含量（以柚皮苷和蕓香柚皮苷總量計）、黃酮醇含量（以蘆丁和槲皮素總量計）進(jìn)行測定。從圖2可知，二氫黃酮醇含量在花后55、65、95、125 d 4個時期均呈上升趨勢，花后65～95 d增幅最大，4個不同發(fā)育時期的果實二氫黃酮醇含量差異均達(dá)顯著水平。從圖3可知，與二氫黃酮醇含量的變化趨勢相反，黃酮醇含量隨著枇杷果實的成熟不斷下降，花后55～65 d降幅最大，4個不同發(fā)育時期果實黃酮醇含量差異均達(dá)顯著水平。

2.3 枇杷果實發(fā)育過程中黃酮醇合成酶FLS基因的表達(dá)

由圖4可知，黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量隨著枇杷果實的成熟而不斷降低，在花后55～65 d下降幅度最大，與黃酮醇含量變化趨勢基本一致。黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量在果實發(fā)育的4個時期之間差異均達(dá)顯著水平。

2.4 黃酮醇含量、二氫黃酮醇含量與黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量的相關(guān)性

利用SPSS 17.0軟件對二氫黃酮醇含量、黃酮醇含量與黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。 在枇杷果實成熟過程中，二氫黃酮醇含量與黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量之間呈顯著負(fù)相關(guān)（圖5），黃酮醇含量與黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（圖6），表明黃酮醇合成酶FLS基因?qū)﹁凌斯麑嶞S酮醇合成具有明顯的調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，隨著枇杷果實的成熟，枇杷果實中黃酮醇含量呈下降趨勢，且各個時期果實中的黃酮醇含量間均存在顯著差異，與Jaakola等[19]在越橘果實中的研究結(jié)果相似。黃酮醇的合成是一個復(fù)雜的過程，黃酮醇合成酶FLS是參與此過程的重要酶類之一。Ben-Meir等[20]從受輻射的歐芹細(xì)胞中第1次觀察到二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮醇，隨后研究人員在紫羅蘭[21]、康乃馨[22]花蕾提取物中也檢測到黃酮醇合成酶FLS的活性。在擬南芥與溫州蜜柑中，黃酮醇合成酶FLS基因被歸為早期基因，在花朵和嫩葉片中的表達(dá)量較高，而在成熟葉片組織中的表達(dá)量較低，主要在植物發(fā)育的早期階段起作用[23]。柑橘果實幼嫩汁胞的黃酮醇含量高于成熟汁胞黃酮醇含量[24]。說明黃酮醇合成酶FLS基因在枇杷果實中可能也是一個早期基因，促使黃酮醇在幼果中積累。

本研究結(jié)果還表明，隨著黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量的降低，黃酮醇含量亦逐漸下降，二者呈現(xiàn)相同的變化趨勢，特別是在果實發(fā)育早期（花后55～65 d），枇杷果實黃酮醇含量的降幅較大，同時黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量的趨勢與之相似，黃酮醇合成酶FLS基因轉(zhuǎn)錄水平與黃酮醇含量相關(guān)性分析表明該基因?qū)S酮醇的積累起到正調(diào)控的作用。目前有許多研究報道關(guān)于黃酮醇合成酶FLS基因的表達(dá)與黃酮醇含量之間的關(guān)系，黃酮醇合成酶FLS基因關(guān)系到黃酮醇合成支路對代謝流的競爭能力，影響著黃酮醇合成支路代謝流的強弱，控制黃酮醇積累[25]。類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)模式的比較表明，黃酮醇合成酶FLS和二氫黃酮醇4還原酶DFR基因的不平衡表達(dá)決定了玫瑰、野薔薇、桃、香石竹、杜鵑、山茶以及矮牽牛7種植物紅花和白花花瓣中黃酮醇類化合物的積累，黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)量越高，花瓣中黃酮醇含量越高;過表達(dá)黃酮醇合成酶FLS基因能夠增強煙草葉片黃酮醇的合成;紫花洋桔梗中抑制黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)，導(dǎo)致花瓣中黃酮醇含量低于檢測限[26]。擬南芥種子萌發(fā)過程中，白光照射能引起擬南芥黃酮醇合成酶FLS1基因在不同組織中的差異性表達(dá)，從而導(dǎo)致黃酮醇不同程度的積累[27]。玉米中黃酮醇合成酶FLS1基因的上調(diào)表達(dá)也會引起組織中黃酮醇含量的上升[28]。對苦蕎麥進(jìn)行NaCl脅迫處理，發(fā)現(xiàn)黃酮醇合成酶FLS基因的上調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)其根、莖、種子內(nèi)黃酮醇的積累[29]。遮陰抑制了葡萄果實中黃酮醇合成酶FLS4基因的表達(dá)，從而抑制果實黃酮醇的積累

[30]。枇杷果實中黃酮醇合成酶FLS基因的表達(dá)與黃酮醇合成趨勢相一致，這與前人的研究相符。枇杷果實中其他與黃酮醇合成相關(guān)酶基因表達(dá)以及酶活性的調(diào)控機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）