高強 唐源苑 鐘麗婭 盧芳國 寧毅 周小青

摘要 目的：觀察新型抗癌復方蟾山護金方含藥血清對肺腺癌A549細胞增殖的影響，并探討其能否誘導A549細胞凋亡。方法：將30只SD大鼠隨機分成3組，分別為含藥血清組、消癌平組、陰性血清組，每組10只，各組依次灌胃蟾山護金方煎劑、消癌平片水溶劑和生理鹽水，制備含藥血清，利用含藥血清做A549細胞增殖抑制實驗（MTT實驗）、細胞凋亡實驗和檢測“死亡蛋白酶”caspase-3的表達變化。結(jié)果：通過MTT實驗，發(fā)現(xiàn)蟾山護金方含藥血清能夠抑制A549細胞的增殖，且呈劑量相關性，與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與消癌平組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)蟾山護金方含藥血清中濃度組和高濃度組誘導A549細胞早期凋亡，與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05）。通過Western-Blot實驗發(fā)現(xiàn)A549細胞caspase-3激活上調(diào)。結(jié)論：新型抗癌復方蟾山護金方含藥血清能抑制A549細胞的增殖并誘導其凋亡，且呈劑量正相關性。

關鍵詞 蟾山護金方;增殖;抑制;細胞凋亡;抗癌;肺腺癌細胞;大鼠

Abstract Objective：To observe the effects of new anticancer prescription of Chanshan Hujin on the proliferation of lung adenocarcinoma A549 cells，and to investigate that whether it could induce the apoptosis of A519.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into three groups of a serum containing drug group，a Xiao-Ai-Ping group and a normal saline group，with 10 rats in each group.Each group was intragastric administrated successively with the Decoction of Chan-Shan-Hu-Jin Prescription，Xiao-Ai-Ping water solvent and normal saline，to prepare the serum containing drug.A549 cell proliferation inhibition test（MTT test），apoptosis assay and detection the expression of “death protease” Caspase-3 was carried out with serum containing drug.Results：Through the cell proliferation inhibition test（MTT test），it was found that the group of Chan-Shan-Hu-Jin Prescription could inhibit the proliferation of A549 cells，and had positive correlation with dose.Compared with the negative group，the difference was significant（P<0.05）.The difference was significant when compared with the Xiao-Ai-Ping group（P<0.05）.The apoptotic detection was carried out by flow cytometry.It was found that the early apoptosis rate after the medium concentration treatment group and high concentration treatment group，and it had significant difference when compared with the negative group（P<0.05，P<0.05）.Western-Blot test showed that the activation of “death protease” caspase-3 was up-regulated.Conclusion：The serum containing drug of Chan-Shan-Hu-Jin Prescription can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A549 cell，and has positive correlation with dose.

Key Words Prescription of Chan-Shan-Hu-Jin; Proliferation; Inhibition; Cell apoptosis; Anti-cancer; Lung adenocarcinoma; Rats

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.009

肺癌特別是肺腺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤，美國癌癥研究中心2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在全球各種新發(fā)腫瘤中，肺癌的發(fā)生率在14%左右，位居第1位[1]。在我國的各種惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率近年來已上升到各種腫瘤的首位，并且惡性程度高，就診時大多數(shù)已到中晚期。目前肺癌的治療主要采取手術治療、放療和化療，但肺癌患者的5年生存率仍然很低[2]，近年來，出現(xiàn)了癌癥分子療法、細胞免疫療法等新治療手段[3]，但技術遠沒有成熟，風險較高，也較少應用于臨床，因此亟需探討一種在肺癌早期抑制其生長的藥物，減緩甚至抑制其生長，以期為肺癌的綜合治療贏得寶貴時間。

中醫(yī)藥是祖國的一大寶庫，歷史記載了大量的抗癌中草藥[4]?，F(xiàn)代中醫(yī)師或研究人員也配制了一些抗癌復方，大多已應用于臨床，有些還做了體外和體內(nèi)小鼠實驗，取得了一定量的研究成果。比如馮青[5]等研究發(fā)現(xiàn)“復方苦參注射液”配合化療提高了老年晚期患者NSCLC的抗腫瘤效果，可有效地減輕化療過程中的不良反應，提高腫瘤患者的生命質(zhì)量。賈彥燾[6]等探討“肺一丸”對LA-795肺癌細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)“肺一丸”能夠有效抑制LA-795肺癌細胞增殖，不良反應小，且可以增加小鼠體質(zhì)量，改善生活狀態(tài)。此外還有應用于臨床的抗癌散類復方藥，例如參七抗癌散、張氏抗癌散、姜氏抗癌散、扶正抗癌散、青龍抗癌散、化瘀解毒抗癌散等[7-10]，對于肺癌治療都取得了一定的臨床效果，但補益藥占據(jù)抗肺癌復方的主流，并且多用于肺癌的中晚期治療。

本文擬用一臨床療效肯定，應用于肺癌早期的中藥復方蟾山護金方（以下簡稱蟾方），有別于上述補益類抗癌復方，在肺癌早期尚未轉(zhuǎn)移，體質(zhì)尚未虛衰之時，用于抑制肺癌細胞生長并誘導其凋亡，防治肺癌毒結(jié)蔓延為根本宗旨，進行體外細胞水平的實驗，驗證其體外抗肺腺癌作用效果，為該復方的臨床應用積累實驗室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，鼠齡8～10周，30只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物購買許可證號SCXK（湘）2013-0004，動物使用許可證號SYXK（湘）2013-0005，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物房中，飼以顆粒飼料，自由飲水，動物房溫度穩(wěn)定在（25±1）℃，相對濕度40%～70%，晝夜交替進行光照，肺腺癌A549細胞系購自于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物 蟾方組方：蟾蜍皮15 g、山慈菇15 g、半枝蓮10 g、蚤休10 g、鱉甲10 g、莪術10 g、浙貝母10 g、百合10 g，中藥飲片購自于湖南中醫(yī)藥大學附屬第一中醫(yī)醫(yī)院藥房，取蟾方1劑，加1 L雙蒸水，侵泡30 min，鱉甲先煎30 min，然后沸水煎藥30 min，倒出煎液，再加雙蒸水1 L，再沸水煎藥30 min，合并2次的湯藥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥1 g/mL，放4 ℃冰箱備用。消癌平片（四川國康藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20053686）中成藥購自湖南中醫(yī)藥大學附屬第一中醫(yī)醫(yī)院藥房。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（貨號940123）、胎牛血清（貨號930236）、胰酶（貨號940341）購自于美國Gibco公司，噻唑藍（MTT，貨號760279）購自于鼎國生物技術有限公司，兔抗大鼠caspase-3抗體（一抗，貨號760297）購自于Santa Cruz公司，HRP標記的羊抗兔IgG（二抗，貨號760292）、兔抗大鼠β-actin抗體（貨號640199）購自于華美生物工程公司，美國BD公司流式細胞儀（型號：FACSCalibur），上海隆拓設備有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號：RE-85A），日本三洋公司CO2培養(yǎng)箱（型號：MCO-5AC）、日本OLYMPUS公司倒置顯微鏡等（型號：OLYMPUS CX23）。

1.2 方法

1.2.1 分組與含藥血清的制備 實驗動物隨機分3組，分別為含藥血清組，消癌平組，生理鹽水組，每組10只。SPF級房間飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，自然光照，適應性飼養(yǎng)3 d后，藥物組灌胃蟾方煎液，消癌平組灌胃消癌平水溶劑，生理鹽水組灌胃等量生理鹽水。按人與大鼠用藥劑量換算公式[大鼠劑量（g/kg）=6.25×成人劑量（g）/成人體質(zhì)量（60 kg）]計算出一般給藥量。蟾方組每只200 g大鼠每天灌胃蟾方煎液1.662 5 g（8.312 5 g/（kg·d）），消癌平組每只200 g大鼠每天灌胃消癌平0.187 5 g（0.937 5 g/（kg·d）），生理鹽水組每只大鼠每天灌胃1 mL生理鹽水，灌胃1次/d，連續(xù)7 d，最后1 d給藥前12 h斷食不斷水，末次給藥后1 h 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心取上清即為含藥血清，同組大鼠血清混合，經(jīng)0.45 μm過濾器過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 給藥方法 人肺腺癌細胞系A549細胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，生長至對數(shù)生長期時正常傳代，選取第3～4代的細胞用于實驗。體外細胞試驗時，分為5組：高劑量蟾方藥物組（20%含藥血清，80%DMEM）、中劑量蟾方藥物組（10%含藥血清，90%DMEM）、低劑量蟾方藥物組（5%含藥血清，95%DMEM，補加5%胎牛血清）、消癌平對照組（10%含藥血清，90%DMEM）、生理鹽水組（陰性對照組）。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 噻唑藍（MTT）法檢測細胞抑制率 取對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)整細胞計數(shù)為1×105細胞/mL，接種于96孔板，試驗分蟾方高、中、低劑量組，消癌平組、生理鹽水組，每組做6個平行，保證每孔細胞數(shù)為5 000個左右，待細胞貼壁后進行試驗，每孔加100 μL試驗藥液（同1.5用藥劑量），分別培養(yǎng)24、48、72 h，在終止實驗前4 h，每孔加入MTT 20 μL，放37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，取出培養(yǎng)板，吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）200 μL，于酶標儀570 nm處測定吸光度（A）值，重復試驗3次，制作吸光度圖表。

1.2.3.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)整細胞計數(shù)為1×106細胞/mL，接種于六塊6孔板，每孔接種1 mL細胞液，實驗分蟾方高、中、低劑量組，消癌平組、生理鹽水組，每組做3個平行，待細胞貼壁后進行試驗，吸去細胞培養(yǎng)液，每孔加400 μL試驗藥液（同1.5用藥劑量），24 h和48 h后分別上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重復試驗3次。

1.2.3.3 Western Blot實驗 采用Western-Blot方法檢測細胞凋亡相關分子caspase-3表達變化，取對數(shù)生長期A549細胞以1×106細胞/孔接種于6孔板內(nèi)，試驗分蟾方高、中、低劑量組、消癌平組、生理鹽水組。待細胞貼壁后，吸去細胞培養(yǎng)液，每孔加400 μL試驗藥液（同1.5用藥劑量），培養(yǎng)48 h，胰酶消化后3 000 r/min離心收集細胞于EP管中，細胞裂解液提取細胞總蛋白，紫外分光光度計測定總蛋白濃度，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩８鹘M分別提取50 μg蛋白，加熱變性，SDS-PAGE膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，0.1% TBST液洗膜3次，一抗（1∶100稀釋）室溫孵育2 h，TBST液洗膜3次，加入二抗稀釋液，避光孵育2 h，TBST液洗膜3次，中途4 ℃過夜。采用增強化學發(fā)光法顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，同時以兔抗大鼠β-actin抗體做對照，試驗重復3次。采用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，分析caspase-3表達陽性積分光密度值，分析相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細胞增殖抑制結(jié)果 應用噻唑藍（MTT）法檢測細胞抑制率。蟾方含藥血清質(zhì)量濃度為5%～20%時對肺腺癌細胞A549的增殖有抑制作用，與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且呈劑量正相關性，并隨著作用時間的延長抑制作用增強，并且20%蟾方含藥血清組與消癌平組比較對肺腺癌細胞A549的增殖抑制差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2 細胞凋亡的檢測結(jié)果 加藥24 h與48 h后經(jīng)過流式細胞儀測定，分析得出陰性對照組A549細胞基本沒有發(fā)生凋亡，消癌平組與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05）;而蟾方低濃度組A549細胞早期凋亡率與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05）;與消癌平組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05;P>0.05）;蟾方中濃度組A549細胞早期凋亡率與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05），與消癌平組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05）;蟾方高濃度組A549細胞早期凋亡率與陰性血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05），與消癌平組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05）。如表2、圖2。

2.3 caspase-3蛋白表達的檢測 加藥48 h后，對caspase-3蛋白表達進行檢測，實驗平行做3次，根據(jù)光密度值測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組比較，低濃度組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），中濃度組和高濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05;P<0.05），并且與濃度成正相關性。和消癌平組比較，低濃度組與中濃度組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05;P>0.05），但高濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明caspase-3隨蟾方含藥血清濃度遞增被激活，表達增強，細胞凋亡發(fā)生。見表3。

3 討論

肺癌屬中醫(yī)學“咳嗽”（從癥狀上）、“息賁”（從病機上）、“肺積”（從病理上）的范疇。中醫(yī)學認為，肺癌的形成是因為正氣內(nèi)虛，衛(wèi)外失司，感受外邪，邪毒凝聚日久，痰瘀毒互結(jié)久滯而成，或長期憂郁悲傷，過度勞累，導致氣機阻滯，氣血津液運行障礙，痰瘀聚結(jié)成積而致。正虛邪實是本病的病理特點，本文認為肺癌在治療上早期宜用清熱解毒、配合理氣活血化痰之藥，后期多配以扶正之中藥調(diào)理氣機，化痰消瘀。蟾方正是遵循這一原則，法從破毒清熱、散結(jié)消腫，臨床療效肯定;方用蟾蜍皮、山慈菇、半枝蓮、蚤休、鱉甲、莪術、浙貝母、百合;蟾蜍、半枝蓮、蚤休破毒清熱為君，山慈菇、莪術、浙貝從瘀、疾、毒3方面軟堅散結(jié)為臣;百合潤肺以散結(jié)為佐;鱉甲入血分以助軟堅為使;諸藥組合，以清熱破毒、散結(jié)消腫之療效。臨床應用于肺腺癌早中期，尚未轉(zhuǎn)移之時，體質(zhì)尚未虛衰，當以解毒結(jié)為主，防止毒結(jié)之蔓延。

研究表明，蟾蜍有較明顯的抗腫瘤效果，蟾皮，通常為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）的干燥表皮，其水溶性成分制劑華蟾素注射液臨床用于肺癌的治療具有較明顯的效果[11-12]。半枝蓮主要在抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、增強機體免疫力等方面發(fā)揮抗腫瘤作用，具有良好的抗肺腫瘤活性。蚤休（七葉一枝花益氣養(yǎng)陰，扶正培本，調(diào)整陰陽，平衡氣血，兼以清熱解毒散結(jié)。蚤休聯(lián)合順鉑能有效抑制小鼠肺腺癌細胞生長，降低血清VEGF、MMP-2水平及腫瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF的表達[13]。莪術性溫味辛苦，有活血破瘀、消積止痛、抗腫瘤的功效[14]。研究發(fā)現(xiàn)莪術油有效成分具有抗腫瘤的效果，可能是通過阻滯細胞周期及誘導凋亡來實現(xiàn)的[15]。浙貝母常與蘇子、半夏合用，取其“十八反”之相反之性，以毒攻毒，溫經(jīng)通絡止痛，燥濕化痰，消結(jié)軟堅，以抗癌消瘤之品治療肺癌[16]。百合潤肺清心、益氣安神，臨床常與地黃或貝母合用有潤肺養(yǎng)陰且化痰止咳之效[17]。鱉甲入肝經(jīng)至陰之分，養(yǎng)陰而入絡搜邪[18]。中醫(yī)認為肺癌是因虛而得病，因虛而致實，是一種全身屬虛，局部屬實的疾病。大量的臨床實踐已證明應用中藥復方或中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌，在減毒增效、提高生命質(zhì)量及延長生存期等方面顯示了明顯優(yōu)勢[19-20]。我們從抗癌中草藥寶庫中精選恰當?shù)乃幬铮谥嗅t(yī)辨證論治的基本思想指導下，通過臨床辨證，嚴格按照中藥復方配伍法則組方蟾方，以期達到單味藥遠不能達到的臨床效果。

通過體外細胞實驗驗證蟾方含藥血清抗肺癌的作用效果，是用實驗數(shù)據(jù)驗證該方抗癌作用的第一步。從MTT試驗可以看出，該方含藥血清有抑制肺腺癌A549細胞增殖的作用，且與藥物濃度的遞增呈正相關性。在凋亡試驗中得出，蟾方有誘導肺腺癌A549細胞凋亡的作用;caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，caspase-3激活上調(diào)則會導致細胞凋亡，通過實驗可以看出caspase-3的表達隨藥物濃度的遞增上調(diào)，從分子角度驗證了蟾方有誘導肺腺癌A549細胞凋亡的作用，并且與藥物濃度的遞增呈正相關性。綜合上述因素，我們通過實驗數(shù)據(jù)驗證了該方的作用效果，這也從體外細胞實驗角度證明了蟾方可能是一早期治療肺癌的有效方劑。下一步，我們將通過體內(nèi)裸鼠實驗進一步驗證該方的體內(nèi)抗癌效果，并通過毒理實驗驗證該方的毒理作用，以及進一步通過信號通路等途徑尋找該方作用靶點并探索其基本作用機制，為臨床應用提供實驗室數(shù)據(jù)參考。

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（2018-11-12收稿 責任編輯：王明）