摘要：? 比較6種大孔樹脂對篤斯越桔花色苷的吸附和解吸效果，篩選適合篤斯越桔分離純化的樹脂類型，并對其吸附性能進(jìn)行研究，獲得適合的樹脂及動態(tài)吸附和解吸的最佳條件。研究結(jié)果表明：AB-8大孔樹脂為越桔花色苷吸附和解吸效果最佳的樹脂類型;花色苷粗提物用pH值為3的緩沖液配制、上樣流速為1.0 mL/min、上樣濃度為1.5 mg/mL、上樣體積為400 mL，采用90 mL的60%乙醇溶液以1.0 mL/min的流速進(jìn)行花色苷解吸，效果較好。

關(guān)鍵詞：? 花色苷;? 篤斯越桔;? 樹脂

中圖分類號：? ?S 663. 9， TS 201. 2? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2019）06 - 0031 - 05

花色苷粗提物中一般含有較多雜質(zhì)，為了提高其純度，便于開展下一步研究，并為其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，應(yīng)對花色苷粗提物進(jìn)行純化處理[ 1 ]。本文比較了6種大孔樹脂對篤斯越桔花色苷的吸附和解吸效果，對其吸附性能進(jìn)行研究，旨在排除其他雜質(zhì)的干擾，為進(jìn)一步研究越桔花色苷的抗氧化活性提供高純度的花色苷，也為越桔花色苷分離純化的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 花色苷粗提物的制備

篤斯越桔果實(shí)采集地位于大興安嶺北部林區(qū)，地理坐標(biāo) 124°25′E、51°43′N，海拔為512 m。8月份，選用水濕地有土生境類型采摘的野生篤斯越桔果實(shí)作為原料，果實(shí)利用液氮研磨破碎，采用乙醇/水/鹽酸（80∶19∶1，v/v）溶劑體系，以1∶24的料液比、650 W的超聲功率進(jìn)行25 min超聲輔助提取，離心取上清液，殘渣以同樣條件提取2次。合并后的上清液在30 ℃下旋蒸濃縮，濃縮液再經(jīng)冷凍干燥得紫黑色的越桔花色苷粗提物，密封放入? -80 ℃冰箱備用。

1. 2 試劑與標(biāo)樣

試驗(yàn)用試劑檸檬酸、檸檬酸納、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇，均為分析純試劑。6種樹脂的物理性質(zhì)見表1，其中，HPD-100、HPD-300型樹脂，購于河北滄州寶恩化工有限公司;AB-8型樹脂，購于天津南開大學(xué)化工廠;LS-300b、NKA-2、NKA-9型樹脂，購于西安藍(lán)深特種樹脂有限公司。標(biāo)樣二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，購于Sigma公司。試驗(yàn)用主要儀器設(shè)備見表2。

1. 3 花色苷含量的測定方法

花色苷含量的測定采用示差法[ 1 ]并略加改進(jìn)?；ㄉ仗崛∫悍謩e與0.025 M的NaCl緩沖液（pH=1）和0.4 M的CH3COONa緩沖液（pH=4.5）以1/8（v/v）的比例混合;與NaCl緩沖液混合的樣品利用分光光度計在400～750 nm的波長范圍內(nèi)掃描，用以確定其最大吸收波長λvis-max，每個花色苷提取樣品均在λvis-max和700 nm的波長下讀取吸光值。所有樣品均在配制15 min后測定，并在1 h內(nèi)完成。將吸光值換算為花色苷含量（TAC），表示為mg二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（MGE）/100 g鮮果（FM）。計算公式

TAC （mg MGE/100g FM） = （A×MW×DF×V）×105/（ε×L×M）

A = （A-A）-（A-A）

式中：A——吸光值;

MW——二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（493 mol/g）;

ε——二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)（21200）;

L——液層厚度（1 cm）;

M——原料鮮果重（g）。

1. 4 最佳樹脂的篩選

1. 4. 1 樹脂預(yù)處理

樹脂在無水乙醇中浸泡溶脹24 h，再用無水乙醇洗至流出液加入適量水至白色渾濁為止，然后用去離子水洗去乙醇，最后吸干樹脂中的水分。

1. 4. 2 樹脂吸附率和解吸率的測定

分別稱取經(jīng)預(yù)處理后的6種樹脂各2 g，放入100 mL三角瓶中，花色苷粗提物用pH值3.0的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液配制成2 mg/mL的溶液，在最大吸收波長λvis-max下測定其吸光值A(chǔ)0。在6個盛有樹脂的三角瓶中分別加入花色苷溶液，再將它們放入水浴振蕩器中，室溫下以150 r/min震蕩12 h，抽濾后測濾液吸光值A(chǔ)1。將50 mL、60%的乙醇溶液（pH=3.0）加入到抽濾的樹脂中，室溫下以150 r/min震蕩12 h，抽濾后測濾液吸光值A(chǔ)2。吸附率α和解吸率β的計算公式

α=（A-A）/A×100%;

β=A /（A-A） ×100%

1. 5 篤斯越桔花色苷的靜態(tài)吸附

1. 5. 1 花色苷在樹脂上吸附平衡時間的測定

將預(yù)處理后的選定樹脂加入到100 mL三角瓶中，再將50 mL、pH 值3.0、吸光值A(chǔ)0的花色苷溶液加入其中，將其置于水浴振蕩器以100 r/min在室溫下震蕩，每隔30 min測定溶液的吸光值A(chǔ)i，吸附率按照公式α=（A0-Ai）/A0×100%計算，并用吸附率對時間作圖，繪制花色苷靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1. 5. 2 花色苷在樹脂上解吸平衡時間的測定

將2 g吸附花色苷的飽和樹脂加入到50 mL、 60%的乙醇溶液（pH=3.0）中，然后在30 ℃下以110 r/min震蕩，每隔30 min吸取200 μL的花色苷解吸液，測定其吸光值，并用解吸率對時間作圖，繪制花色苷靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線。

1. 5. 3 pH值對樹脂吸附花色苷影響的測定

用緩沖液配制成不同pH值（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）、濃度為2 mg/mL的花色苷溶液，分別測定其吸光值A(chǔ)0;吸取各pH值的花色苷溶液50 mL加入到裝有2 g樹脂的100 mL三角瓶中，置于水浴振蕩器中以100 r/min在室溫下震蕩，吸附后測定吸光值A(chǔ)1，并計算吸附率。

1. 5. 4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對樹脂吸附花色苷影響的測定

將50 mL不同體積分?jǐn)?shù)的最佳pH值的乙醇溶液（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）分別加入到裝有2 g吸附花色苷飽和樹脂的100 mL三角瓶中，置于水浴振蕩器中以100 r/min在室溫下震蕩，測定不同體積分?jǐn)?shù)的花色苷洗脫液的吸光值A(chǔ)2，并計算解吸率。

1. 6 篤斯越桔花色苷的動態(tài)吸附

1. 6. 1 吸附流速對樹脂吸附花色苷的影響

取20 g預(yù)處理后的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，利用緩沖液配制最佳pH值的花色苷溶液，其吸光值為A0，分別采用不同的流速（0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min）使一定體積的花色苷溶液流經(jīng)樹脂柱;溶液全部通過樹脂柱后，分別測定各流速下的流出液吸光值A(chǔ)1，并計算其吸附率。

1. 6. 2 粗提物濃度對樹脂吸附花色苷的影響

將篤斯越桔花色苷粗提物用最佳pH值的緩沖液配制成不同濃度的溶液（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL），并分別測定它們的吸光值A(chǔ)0，以最佳流速使花色苷溶液流經(jīng)樹脂柱，溶液全部通過樹脂柱后，檢測不同粗提物濃度流出液的吸光值A(chǔ)1，并計算吸附率。

1. 6. 3 樹脂吸附花色苷泄露曲線的繪制

花色苷溶液以最佳濃度上樣于樹脂柱，并以最佳流速通過（樹脂柱），流出液每10 mL收集1次流份，并測定每個流份的吸光值。若流出液吸光值達(dá)到樣液吸光值的1/10，則認(rèn)為此時樹脂對花色苷物質(zhì)的吸附已達(dá)到飽和狀態(tài)，停止上樣，并繪制出泄露曲線。

1. 6. 4 上樣流速對樹脂解析花色苷效果影響的測定

花色苷溶液以最佳濃度上樣于樹脂柱，并以最佳流速通過（樹脂柱）;達(dá)到吸附飽和后，利用100 mL最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液、以不同的流速（0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min）進(jìn)行洗脫，并測定洗脫液的吸光值。

1. 6. 5 篤斯越桔花色苷洗脫曲線的繪制

取20 g預(yù)處理后的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，花色苷溶液以最佳濃度上樣于樹脂柱，并以最佳流速通過（樹脂柱）;達(dá)到吸附飽和后，用最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液、以最佳流速洗脫，每10 mL收集1次流份，并測定每個流份的吸光值，繪制洗脫曲線。

1. 6. 6 花色苷得率、回收率和純度的計算

收集洗脫液，在30 ℃下旋蒸濃縮后冷凍干燥。計算公式[ 2 ]

得率（%）=（純化樣品質(zhì)量/藍(lán)莓果實(shí)質(zhì)量）×100%

回收率（%）=（實(shí)際回收花色苷質(zhì)量/理論回收花色苷質(zhì)量）×100%

純度（%）=（純化樣品中花色苷含量/純化樣品質(zhì)量）×100%

1. 7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3次測定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，利用Microsoft Excel 2007軟件和SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。圖表中標(biāo)注的不同英文小寫字母，表示同一項(xiàng)目的數(shù)據(jù)結(jié)果存在顯著差異（p<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2. 1 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂對化合物的吸附作用主要是通過分子間的范德華力來實(shí)現(xiàn)，其次是氫鍵，被吸附分子的極性、樹脂的極性、大孔樹脂的比表面積和孔徑等因素都會對吸附效果造成影響。基于花色苷純化已有的報道，本研究選擇了6種效果較好的樹脂進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，6種樹脂對篤斯越桔花色苷的吸附程度和解吸程度存在一定差異（表3）。

對于吸附性能，非極性樹脂HPD300和弱極性樹脂AB-8的吸附率較高，分別為79.68%和76.56%，可能因?yàn)榛ㄉ諏儆谌鯓O性化合物，同時具有一定的極性和親水性，所以有利于非極性和弱極性樹脂的吸附;其他4種樹脂NKA-2、NKA-9、LS-

300b和HPD-100的吸附率相對較低，在70%～74%之間。對于解析性能，弱極性樹脂AB-8的解吸率最高，為69.89%;其次是極性樹脂NKA-2和非極性樹脂HPD-100，分別為59.78%和54.72;而極性樹脂NKA-9和非極性樹脂HPD-300的解吸率最低，分別為51.74%和51.34%。綜合各種樹脂的吸附性能和解析性能分析，后續(xù)研究均選擇AB-8大孔樹脂進(jìn)行篤斯越桔花色苷的純化。

2. 2 AB-8對篤斯越桔花色苷的靜態(tài)吸附

理想的樹脂不僅吸附速率快、吸附量大，而且具有較好的選擇性和較高的解吸速率。大孔樹脂AB-8對篤斯越桔花色苷的吸附和解吸動力學(xué)曲線（圖1）顯示，AB-8對花色苷的吸附特點(diǎn)屬于快速平衡型，在開始的2.5 h內(nèi)對花色苷的吸附量呈迅速增加，吸附速率較快;在之后的1.5 h內(nèi)速率漸緩，約4 h時基本達(dá)到平衡。AB-8對花色苷的解吸效果為：在開始的2 h內(nèi)對花色苷的解吸量不斷增加，解吸速率較快;在之后的0.5 h內(nèi)解吸速率漸緩，約2.5 h時解吸基本達(dá)到平衡。

在不同pH值的溶液中，由于花色苷分子存在4種結(jié)構(gòu)形式的比例不同，導(dǎo)致花色苷分子的極性和穩(wěn)定性也存在較大差異（圖2）。pH值對AB-8吸附篤斯越桔花色苷的吸附率具有較大影響，表現(xiàn)為隨著pH值的升高，AB-8對花色苷的吸附率逐漸降低，由pH值 1.0時的83.87%下降到pH值 6.0時的72.46%，這是由于花色苷在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。但pH值為1.0、2.0、3.0時的花色苷吸附率不存在顯著差異，由于較低的pH值容易使花色苷的糖基發(fā)生水解現(xiàn)象，影響花色苷分子的穩(wěn)定性，所以選擇pH值3.0最適合。

乙醇可以使大孔樹脂溶脹，消弱樹脂與被吸附分子之間的吸附力，并且可溶解被吸附分子。如圖3所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，AB-8對花色苷的解吸率也不斷增加，解吸率由20%乙醇溶液時的40.23%增加到60%乙醇溶液時的75.75%;但再加大乙醇體積分?jǐn)?shù)，解吸率的變化不大，60%、70%和80%乙醇溶液時的解吸率無顯著差異。

2. 3 AB-8對篤斯越桔花色苷的動態(tài)吸附

在動態(tài)吸附中，上樣流速的變化，可以使花色苷分子與樹脂接觸的時間發(fā)生變化，吸附率也會隨之改變。圖4顯示，隨著上樣流速的增加，AB-8對篤斯越桔花色苷的吸附率呈下降趨勢，由流速為0.5 mL/min時的92.78%下降到2.0 mL/min時的82.89%;流速為0.5 mL/min和1.0 mL/min的吸附率沒有明顯差異，當(dāng)流速上升到1.5 mL/min時吸附率才顯著下降。流速過緩會導(dǎo)致試驗(yàn)周期延長，所以選擇1.0 mL/min的上樣流速較為適合。

上樣濃度也會影響到樹脂的吸附效果，樣品濃度過高，會導(dǎo)致吸附不完全。圖5顯示，隨著上樣濃度的增加，AB-8對花色苷的吸附率呈下降趨勢。上樣濃度由0.5 mg/mL上升到1.5 mg/mL的過程中，吸附率的變化并不明顯，保持在90%以上;當(dāng)上樣濃度為2.0 mg/mL時，吸附率顯著下降;上樣濃度達(dá)到3.0 mg/mL時，吸附率下降到73.56%。綜合上述分析，選擇1.5 mg/mL的上樣濃度較為合適。

AB-8大孔樹脂對花色苷的吸附泄漏曲線顯示（圖6），流出液的吸光值隨著上樣體積的增加而增加。流出液體積由0 mL到350 mL的過程中，其吸光值的增加幅度較緩;而在流出液體積由350 mL上升到450 mL的過程中，其吸光值的增加幅度明顯加大;當(dāng)流出液體積為400 mL時，其吸光值已達(dá)到上樣溶液吸光值的1/10，即出現(xiàn)泄漏。

洗脫液的流速也會影響到樹脂的解吸效果，如果流速過快，洗脫劑不能與被吸附的花色苷分子充分作用，洗脫的效果就會下降;如果流速過低，則會延長試驗(yàn)和生產(chǎn)周期。如圖7所示，隨著洗脫流速的增加，洗脫液的吸光值逐漸下降，從流速0.5 mL/min時的0.45，下降到2.0 mL/min時的0.39;但0.5 mL/min和1.0 mL/min的洗脫液吸光值差異不顯著，所以選擇1.0 mL/min的洗脫流速較適合。

大孔樹脂AB-8對篤斯越桔花色苷粗提物的洗脫曲線（圖8）顯示，利用60%的酸性乙醇溶液可以較好地解吸被吸附的花色苷，洗脫峰較為集中，但同時也存在一定的拖尾現(xiàn)象。當(dāng)洗脫液為30 mL時，開始檢測到有花色苷流出;50 mL時，花色苷的含量達(dá)到最高值，此時被洗出的花色苷達(dá)到上樣花色苷總量的76.33%;洗脫液用去90 mL時，已洗脫出上樣花色苷總量的96.33%，即4.5倍柱床體積的60%酸性乙醇溶液基本上可以將篤斯越桔花色苷洗脫下來。經(jīng)計算，AB-8純化篤斯越桔果實(shí)花色苷的得率為2.12%，回收率為81.63%，純度為90.11%。有文獻(xiàn)記載，采用不同類型大孔樹脂對漿果中花色苷的回收率在75%～90%之間[ 3 - 4 ]，與前人的研究相比，本試驗(yàn)對篤斯越桔花色苷的純化效果較好。

3 小 結(jié)

3. 1 通過對6種大孔樹脂進(jìn)行篩選，確定AB-8為篤斯越桔花色苷吸附和解吸效果最佳的樹脂類型。

3. 2 AB-8對篤斯越桔花色苷的吸附平衡時間為4 h，解吸平衡時間為2.5 h，花色苷粗提物適宜用pH=3的緩沖液配制;解吸時宜采用體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性乙醇溶液。

3. 3 動態(tài)吸附和解吸的最佳條件為：上樣流速 1.0 mL/min，上樣濃度1.5 mg/mL，上樣體積400 mL;采用90 mL（即4.5倍柱床體積）的60%乙醇溶液，以1.0 mL/min的解吸流速可將花色苷基本洗脫下來。

3. 4 AB-8純化篤斯越桔果實(shí)花色苷的得率為2.12%，回收率為81.63%，純度為90.11%。

參考文獻(xiàn)

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第1作者簡介：? 勾智麗（1976-），? 女，? 高級講師，? 主要研究方向：? 林業(yè)科學(xué)。

收稿日期： 2019 - 10 - 14

（責(zé)任編輯：? ?潘啟英）