王超群 李點(diǎn) 劉慧萍 李玲

〔摘要〕 目的 研究養(yǎng)陰潤目丸對干眼模型大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6（Caspase-6）表達(dá)的影響。方法 將50只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分成5組，10只/組，分別為正常組、假手術(shù)組、模型組、養(yǎng)陰潤目丸組、杞菊地黃丸組。模型組、養(yǎng)陰潤目丸組、杞菊地黃丸組3組均采用去勢法建立干眼模型。各組予以相應(yīng)干預(yù)，干預(yù)30 d后，取大鼠結(jié)膜上皮組織，采用Tunel法檢測Caspase-3、Caspase-6的陽性表達(dá)率。結(jié)果 養(yǎng)陰潤目丸組和杞菊地黃丸組結(jié)膜上皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-6的陽性表達(dá)明顯低于模型組（P<0.05）。結(jié)論 養(yǎng)陰潤目丸對干眼的作用機(jī)制可能是與降低結(jié)膜上皮細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-6的表達(dá)活性從而阻斷相關(guān)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 養(yǎng)陰潤目丸;干眼;結(jié)膜上皮細(xì)胞;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6

〔中圖分類號〕R285.5;R276.7? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.012

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Yangyin Runmu Pills on the expression of Cysteine aspartase-3 （Caspase-3） and Cysteine aspartase-6 （Caspase-6） in conjunctival epithelial cells in a rat model of dry eye. Methods A total of 50 Sprague-Dawley （SD） male rats were randomly divided into 5 groups： normal group， sham operation group， model group， Yangyin Runmu Pills group， Qiju Dihuang Pills group， with 10 rats in each group. The model group， the Yangyin Runmu Pills group and the Qiju Dihuang Pills group were prepared as the models of dry eye by using the method of ovariectomy. Each group was given corresponding intervention. After 30d intervention， the conjunctival epithelial tissues were taken to test the positive expressive rate of Caspase-3 and Caspase-6 by Tunel assay. Results The positive expressive rates of Caspase-3 and Caspase-6 in conjunctival epithelial cells in the Yangyin Runmu Pills group and the Qiju Dihuang Pills group were significantly lower than that of the model group （P<0.05）. Conclusion The mechanism of action of Yangyin Runmu Pills on dry eye may be related to the inhibition of Caspase-3 and Caspase-6 expressive activities in conjunctival epithelial cells， thereby blocking the correlation of related apoptosis cascade reactions.

〔Keywords〕 Yangyin Runmu Pills; dry eye; conjunctival epithelial cells; Caspase-3; Caspase-6

干眼（dry eye disease， DED）是眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經(jīng)感覺異常[1]。干眼是眼科常見病，老年人患病多與自身因素相關(guān)，其患病率隨年齡呈線性增長[2]。近年來隨著手機(jī)、電腦、角膜接觸鏡的普及使用，睡眠時(shí)間的減少，空氣污染等多種因素的影響，干眼的患病率逐步呈年輕化趨勢[3-5]。項(xiàng)目組前期研究表明[6-7]，對于干眼的治療，養(yǎng)陰潤目丸具有良好臨床療效，而養(yǎng)陰潤目丸治療干眼的有效作用機(jī)制尚不明確，本項(xiàng)目組擬通過建立干眼動物模型，研究養(yǎng)陰潤目丸對大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6（Caspase-6）的表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級7～8周健康SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，由湖南省長沙市斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司提供（動物許可證號：SCXK（湘）2014-0002）。所有動物均通過淚液分泌試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間篩查，檢查正常方可使用。統(tǒng)一飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心，控制室溫（23±2）℃，相對濕度53%～57%。

1.2? 藥品及主要試劑

養(yǎng)陰潤目丸（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供），杞菊地黃丸（九芝堂股份有限公司，201505001）。Caspase-3（PB0183）、Caspase-6（BA3328）、4%多聚甲醛（AR1069）、Tunel檢測試劑盒（MK1020）均來自武漢博士德公司。淚液檢測濾紙條（天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司，20150903）。

1.3? 主要儀器

Shandon 325 型石蠟切片機(jī)（英國珊頓公司），MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司），研究型正置顯微鏡（olympus）。

1.4? 分組與給藥方法

按隨機(jī)數(shù)字表法將50只SD雄性大鼠分成5組，10只/組，分別為正常組、假手術(shù)組、模型組、養(yǎng)陰潤目丸組、杞菊地黃丸組。正常組不做任何處理，假手術(shù)組只切開陰囊而不切除睪丸及附睪，模型組、養(yǎng)陰潤目丸組、杞菊地黃丸組3組大鼠參照干眼動物模型的操作[8-9]，切除睪丸及附睪。術(shù)后常規(guī)消毒、保溫、分籠飼養(yǎng)。養(yǎng)陰潤目丸組、杞菊地黃丸組分別以藥物0.94 g/kg與生理鹽水混懸液灌胃，1次/d;正常組、假手術(shù)組、模型組3組分別以生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃30 d。

1.5? Tunel法檢測Caspase-3、Caspase-6

各組大鼠治療30 d后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，剪刀分離大鼠眼球周邊組織并剝離出眼球結(jié)膜上皮，4%多聚甲醛固定后冷存待檢。常規(guī)石蠟包埋、切片。3% H2O2去離子水孵育10 min，蒸餾水洗2 min×2次，Proteinase K（1∶200稀釋）消化10 min，滴加標(biāo)記緩沖液（20 μL）2 h后，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加封閉液室溫保存30 min，滴加生物素化抗地高辛抗體（1∶100稀釋），室溫孵育10 min后，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加Caspase-3或Caspase-6抗體（1∶100稀釋），室溫孵育30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min×3次，然后DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片。高倍鏡下觀察每張涂片，至少觀察5個(gè)視野以上，計(jì)數(shù)視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，如細(xì)胞核中有明顯的棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性表達(dá)，即凋亡的細(xì)胞，分別計(jì)算其陽性細(xì)胞比率。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPPS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示。如符合正態(tài)性及方差齊性，則用多因素方差分析兩兩比較法;如不符合正態(tài)性及方差齊性，則用非參多重比較法。以P<0.05（雙側(cè)檢驗(yàn)）為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

治療30 d后，正常組、假手術(shù)組結(jié)膜上皮細(xì)胞核內(nèi)幾乎無明顯棕黃色或棕褐色，即Caspase-3、Caspase-6幾乎無陽性表達(dá);養(yǎng)陰潤目丸組和杞菊地黃丸組結(jié)膜上皮部分細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色沉著，及Caspase-3、Caspase-6存在不同程度陽性表達(dá)，分別與正常組、假手術(shù)組比較，結(jié)膜上皮細(xì)胞凋亡陽性比率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但養(yǎng)陰潤目丸組與杞菊地黃丸組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;模型組結(jié)膜上皮細(xì)胞核內(nèi)可見大量棕黃色沉著，即Caspase-3、Caspase-6大量陽性表達(dá)，結(jié)膜上皮細(xì)胞凋亡陽性比率分別同養(yǎng)陰潤目丸組和杞菊地黃丸組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1-2。

3 討論

已有研究表明[10]，角結(jié)膜上皮細(xì)胞的凋亡，被認(rèn)為是損傷眼表正常形態(tài)與功能的主要途徑。處于細(xì)胞凋亡下游的蛋白酶家族Caspases家族在凋亡早期啟動并傳遞凋亡信號，于凋亡晚期作用于不同凋亡底物，使其產(chǎn)生細(xì)胞皺縮、DNA斷裂等凋亡特征現(xiàn)象[11]。Caspases-3是細(xì)胞凋亡效應(yīng)子，其降解凋亡標(biāo)志底物的活性最強(qiáng)[12]，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。而Caspases-6能被上游的啟動子激活，作用于凋亡標(biāo)志底物使細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變。Caspases-3和Caspases-6之間的相互活化可能與Caspase的級聯(lián)放大效應(yīng)有關(guān)[13]。因此，通過干預(yù)Caspases-3、Caspases-6蛋白酶的表達(dá)，就有可能阻斷其相關(guān)細(xì)胞凋亡通路級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。

干眼屬于中醫(yī)學(xué)“白澀癥”范疇。臨床表現(xiàn)為“不腫不赤，不得爽快，沙澀昏朦，名曰白澀”（《審視瑤函》）。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“淚乃肝之液”（《銀海精微》），“腎主津液，潤養(yǎng)目珠”，當(dāng)肝腎虧虛，淚液分泌不足，目失滋潤，則致干眼。養(yǎng)陰潤目丸具有滋養(yǎng)肝腎、生津潤燥功效，治療干眼，臨床療效顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，以模型組與正常組、假手術(shù)組比較，大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中Caspases-3、Caspases-6陽性表達(dá)率均有顯著性差異，證實(shí)細(xì)胞凋亡機(jī)制與干眼的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。經(jīng)過養(yǎng)陰潤目丸的干預(yù)后，大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞中Caspases-3、Caspases-6的陽性表達(dá)率要明顯低于模型組，由此我們推斷，通過降低Caspases-3、Caspases-6的表達(dá)活性，以阻斷相關(guān)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，可能是養(yǎng)陰潤目丸有效治療干眼的作用機(jī)制，其關(guān)鍵因素是否是養(yǎng)陰潤目丸中的某些有效成分或是滋養(yǎng)肝腎治法，還有待進(jìn)一步探索。

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