趙洪慶 杜青 柳卓 向韻 劉林 孟盼 王宇紅

〔摘要〕 目的 對比分析不同抑郁模型大鼠的生物學特點，為抑郁模型研究提供實驗依據(jù)。方法 40只SD大鼠隨機分為空白對照組、溶媒對照組、束縛應激組、慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）組，皮質酮注射組，每組8只。除對照組外，各組分別進行造模，時間均為21 d，造模結束后采用Morris水迷宮測試、曠場實驗、強迫游泳實驗檢測大鼠的抑郁樣行為，蛋白印跡法檢測大鼠海馬和前額葉皮質區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）的含量。結果 與對照組比較，3種模型組大鼠逃避潛伏期時間均顯著增加（P<0.01），但只有皮質酮組大鼠進入目標象限潛伏期時間增加（P<0.05）;曠場測試中活動次數(shù)顯著下降，其中CUMS組和皮質酮組對比束縛組有顯著差異（P<0.01）;同時，3種模型組大鼠強迫游泳中的不動時間均顯著增加（P<0.01）;此外，與對照組比較，各模型組大鼠海馬和前額葉皮質區(qū)BDNF、NGF表達均顯著下降（P<0.01或P<0.05），但各模型組之間相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 慢性束縛應激、CUMS、慢性皮質酮注射均能使大鼠產(chǎn)生明顯的抑郁樣行為，且在腦內神經(jīng)營養(yǎng)表達上差異無統(tǒng)計學意義。

〔關鍵詞〕 抑郁模型;慢性不可預見性溫和應激;束縛應激;皮質酮注射;神經(jīng)營養(yǎng)因子

〔中圖分類號〕R965.1;R749.4&nbsp; ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.007

〔Abstract〕 Objective To compare and analyze the biological characteristics of different depression model rats， and to provide experimental basis for the study of depression models. Methods A total of 40 SD rats were randomly divided into a blank control group， a vehicle control group， a restraint stress group， a chronic unpredictable mild stress （CUMS） group and a corticosterone injection group， with 8 rats in each group. Except for the control groups， each group was modeled separately for 21 days. Morris water maze test， open-field test and forced swimming test were used to test the rats' depression-like behaviors. The protein expressions of brain-derived neurotrophic factors （BDNF） and nerve growth factors （NGF） in the hippocampal and prefrontal cortex were detected by Western blotting. Results Compared with the control groups， the escape latency time of the 3 model groups was significantly increased （P<0.01）， but only the target quadrant time of rats in the corticosterone injection group was increased （P<0.05）. The number of activities in the open-field test was decreased significantly， and the numbers in the CUMS group and the corticosterone injection group were significantly different from that in the restraint stress group （P<0.01）. Meanwhile， the immobility time of rats in the 3 model groups was significantly increased （P<0.01）. In addition， compared with the control groups， the expressions of BDNF and NGF in hippocampal and prefrontal cortex in each model group were significantly decreased （P<0.01 or P<0.05）， but there was no significant difference between each 2 model groups （P>0.05）. Conclusion Chronic restraint stress， CUMS and chronic corticosterone injection can produce significant depressive behaviors in rats， and there is no statistically significant difference in the neurotrophic expression of the brain.

〔Keywords〕 depressive model; chronic unpredictable mild stress; restraint stress; corticosterone injection; neurotrophic factor

抑郁癥是一種以心境低落、思維遲鈍、語言行動減少等為主要特征的情感障礙性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計，抑郁癥已成為給人類造成嚴重負擔的第2位致病因素[2]。雖然目前關于抑郁癥的研究十分廣泛，然而，其確切的發(fā)病機制仍未有完全闡明?？陀^、規(guī)范、重復性好的動物模型是研究疾病發(fā)病機制的重要基礎，目前，關于抑郁模型造模方法的相關報道較多，公認的造模方法包括慢性不可遇見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）、嗅球摘除、皮質酮注射、社會挫敗模型、慢性束縛應激、基因敲除等[3-4]。本研究中，主要對比3種公認的抑郁模型，包括國內外廣泛使用的CUMS模型、國際上廣泛使用的慢性皮質酮注射模型以及操作簡便、中醫(yī)證候研究常用的慢性束縛應激模型，分析各模型大鼠行為學特點以及海馬、前額葉皮質部位的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）表達情況，為抑郁模型研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，雄性，體質量為200～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘） 2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物中心，使用許可證號為SYXK（湘）2015-0003。

1.2? 主要試劑與儀器

皮質酮（索萊寶，北京）;生理鹽水、水合氯醛（中杉金橋，北京）;兔抗鼠BDNF、NGF、GAPDH多克隆抗體（Abcam，英國）;RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP二抗（博士德，武漢）。Morris水迷宮（泰盟，成都）;超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop，英國）;凝膠成像分析儀（Bio-Rad，美國）;多功能酶標儀（Thermo，美國）;萬分之一天平（梅特勒-托利多，瑞士）。

1.3? 分組與造模

大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，將40只SD大鼠隨機分為5組，包括空白對照組、溶媒對照組、束縛應激組、CUMS組、皮質酮注射組，每組8只?？瞻讓φ战M大鼠正常飼養(yǎng)，溶媒對照組大鼠每天皮下注射生理鹽水（2 mL/kg）。除對照組外，各模型組大鼠均孤籠飼養(yǎng)，具體造模方法如下。

1.3.1? 束縛應激組[5]? 采用特制束縛器固定大鼠，每天束縛6 h，時間段為9：00-15：00，共21 d。? ? ? ? 1.3.2? CUMS組[6]? 應激方法包括禁食禁水、冰水浴、50 V電擊、傾籠、噪音、晝夜顛倒、潮濕墊料、夾尾，每天隨機采用1～2種，且同種應激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)21 d。

1.3.3? 皮質酮注射組[7]? 給予大鼠皮下注射皮質酮（40 mg/kg），持續(xù)21 d。

造模結束后，各組大鼠均進行行為學測試，評價抑郁樣行為，測試完成后腹腔注射水合氯醛（10 mL/kg）麻醉大鼠，斷頭取腦，冰上剝離海馬和前額葉皮質區(qū)用于組織蛋白檢測。

1.4? 行為學測試

1.4.1&nbsp; Morris水迷宮實驗? （1）定位航行實驗：于應激造模第17天開始進行航行訓練，將大鼠從平臺正對象限處面向池壁放入水中，自由尋找平臺，若在60 s內未找到，則將其牽引至平臺并停留15 s，每天訓練1次，持續(xù)4 d。訓練完成后，開始正式實驗，記錄大鼠爬上平臺的時間，記為大鼠的逃避潛伏期時間（escape latency），若60 s內未找到平臺，則記為60 s。（2）空間探索實驗：于造模第21天撤去平臺，仍將大鼠從同一位置放入水中，記錄大鼠60 s內穿越原平臺所在象限的次數(shù)（crossing target）和進入原平臺所在象限的潛伏時間（latency time）。

1.4.2? 曠場測試? 于測試前30 min將大鼠放入測試房間中適應，測試時，每只大鼠均從敞箱同一位置放入，分別記錄大鼠4 min內的水平和垂直活動次數(shù)，并計算總和為大鼠的自主活動能力評分，整個測試過程保持絕對安靜。

1.4.3? 強迫游泳實驗? 將大鼠放入圓柱形強迫游泳測試儀中，水深距離儀器頂端約10 cm，水溫保持在室溫。實驗時間共計5 min，其中前1 min為適應時間，讓大鼠自由活動，適應結束后記錄后4 min內大鼠的不動時間（immobility time），大鼠不動的標準為兩前爪不動且身體呈漂浮狀態(tài)。

1.5? Western-blotting法檢測BDNF、NGF蛋白含量

取冷凍保存的海馬及前額葉皮質組織，按1∶5比例加入RIPA裂解液，冰上勻漿，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒法測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍跑出分離膠后，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗（BDNF，1∶1 000;NGF，1∶1 000;GAPDH，1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗（按1∶2 000稀釋），室溫下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后進行ECL顯影。應用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，根據(jù)目的蛋白和內參蛋白對應灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達量。

1.6? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD法，方差不齊者用Dunnett's T3法。本研究涉及的與對照組比較中，束縛應激組和CUMS組均是與空白對照組比較，皮質酮組與溶媒對照組比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 行為學測試

2.1.1? Morris水迷宮測試? 與空白對照組比較，各抑郁模型組大鼠的逃避潛伏期時間均顯著上升（P<0.01），穿越目標次數(shù)顯著下降（P<0.05或P<0.01）;同時，皮質酮組大鼠進入目標象限潛伏期時間顯著上升（P<0.05），而其余兩模型組差異無統(tǒng)計學意義，結果見表1。

2.1.2? 曠場測試? 與空白對照組比較，各模型組大鼠自主活動次數(shù)均顯著下降（P<0.05或P<0.01），但是，CUMS組和皮質酮組大鼠活動次數(shù)下降的更為顯著，同時與束縛組比較有顯著差異（P<0.05），而CUMS組與皮質酮組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

2.1.3? 強迫游泳實驗? 與對照組比較，各模型組大鼠不動時間均顯著增加（P<0.01），與束縛組比較，皮質酮組不動時間顯著增加（P<0.05），與CUMS組比較，則差異無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

2.2? BDNF、NGF蛋白表達情況

與空白對照組比較，各模型組大鼠海馬、前額葉皮質區(qū)BDNF、NGF含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且各模型組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義。結果見圖1-2。

3 討論

抑郁癥是一種嚴重的神經(jīng)精神疾病，患者表現(xiàn)出思維遲緩、學習記憶下降、活動不能、行為絕望等特征，嚴重者有自殺念頭及行為，嚴重威脅人類身心健康。據(jù)報道，2016年抑郁癥全球發(fā)病率為3.2%，且有逐年提升的趨勢，預測到2020年，將成為僅次于心臟病的人類第二大疾患[8]。慢性應激是導致抑郁癥發(fā)生的關鍵原因之一，同時也是基礎研究用于建立抑郁動物模型的經(jīng)典方法。本實驗通過對比3類不同的抑郁動物模型應激方法，從動物行為學及腦內神經(jīng)營養(yǎng)兩方面，探討各抑郁模型的特點，為抑郁動物模型的對比提供實驗依據(jù)。

Morris水迷宮是一種空間辨別性學習記憶的經(jīng)典檢測方法，廣泛用于神經(jīng)科學領域的基礎研究[9]。本研究通過Morris水迷宮測試模擬抑郁患者的思維遲緩、學習記憶下降等特點，結果表明，3種抑郁模型方法均能導致大鼠逃避潛伏期時間延長，說明均能使大鼠產(chǎn)生學習能力障礙，然而，只有慢性皮質酮注射組大鼠進入目標象限時間顯著增加，說明3種模型中，只有皮質酮注射會導致大鼠產(chǎn)生明顯的記憶功能障礙。

曠場實驗又稱為敞箱實驗，是評價動物在新環(huán)境中發(fā)揮探索本能的一種行為學測試方法，主要用于評價動物的焦慮或抑郁樣情緒[10]。強迫游泳實驗是使動物處于絕望環(huán)境下，反映動物即時的表征變化，是篩選抗抑郁藥物的經(jīng)典實驗方法[11]。本研究通過曠場實驗和強迫游泳實驗模擬抑郁患者的運動不能及行為絕望等特點，結果表明，3種模型大鼠活動次數(shù)均降低，不動時間均增加，顯示明顯的抑郁樣行為，同時，對比慢性束縛大鼠，CUMS組和皮質酮注射組大鼠抑郁樣行為更為顯著，上述結果表明CUMS組和皮質酮組大鼠較束縛應激組具備更典型的抑郁特征。

海馬和前額葉皮質是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，海馬主要調控機體的學習與記憶，而前額葉皮質則主要負責感覺認知[12]。雖然海馬和前額葉皮質區(qū)在大腦不同的部位且掌管的功能各有不同，然海馬與前額葉皮質之間有著錯綜復雜的直接生理結構聯(lián)系，可相互影響共同調節(jié)情緒行為、學習記憶等心理活動，與抑郁癥的產(chǎn)生緊密相關[13]。因此，本研究以海馬和前額葉皮質為關鍵靶區(qū)，對比各抑郁模型大鼠腦內神經(jīng)營養(yǎng)的表達水平，分析各模型的特點。

神經(jīng)營養(yǎng)假說是近年來抑郁癥發(fā)病機制研究的一大熱點，該假說認為神經(jīng)營養(yǎng)因子的減少是誘發(fā)抑郁癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族是一類由神經(jīng)所支配的組織和星形膠質細胞產(chǎn)生的且為神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質分子，具有保護神經(jīng)元、促進軸突再生等多重作用[14]。BDNF、NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的代表性成員，在調節(jié)神經(jīng)元生長分化，降低神經(jīng)元凋亡等方面有重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF和NGF的表達降低可引起海馬、皮質中的神經(jīng)元形態(tài)、功能損傷而參與抑郁癥的發(fā)病[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，各抑郁模型大鼠海馬和前額葉皮質的BDNF、NGF表達均明顯下調，但各模型組之間比較無明顯差異，提示此3種抑郁模型大鼠均存在明顯的神經(jīng)營養(yǎng)缺失情況，在該發(fā)病機制下均無顯著差異。

綜上所述，本研究通過對比慢性束縛應激、CUMS、慢性皮質酮注射3種常用的抑郁模型，行為學分析發(fā)現(xiàn)慢性皮質酮注射大鼠抑郁特征最為顯著，同時，各模型大鼠海馬和前額葉皮質部位的BDNF、NGF含量均有明顯的改變，但相互間比較并無統(tǒng)計學意義，說明腦內神經(jīng)營養(yǎng)缺失現(xiàn)象存在，也說明3種抑郁模型均符合抑郁癥發(fā)病特點，能為抑郁癥發(fā)病機制研究及治療藥物篩選提供穩(wěn)定的模型基礎。

參考文獻

[1] 吳志國，吳? 彥，方貽儒.從“焦慮性抑郁癥”概念解析抑郁障礙的復雜性[J].上海交通大學學報（醫(yī)學版），2014，34（4）：450-454.

[2] IONESCU D F， NICIU M J， MATHEWS D C， et al. Neurobiology of anxious depression： a review[J]. Depress Anxiety， 2013， 30（4）：374-385.

[3] ROSA S G， QUINES C B， STANGHERLIN E C， et al. Diphenyl

diselenide ameliorates monosodium glutamate induced anxiety-like behavior in rats by modulating hippocampal BDNF-Akt pathway and uptake of GABA and serotonin neurotransmitters[J]. Physiology and Behavior， 2016，155：1-8.

[4] WANG Q S， TIAN J S， CUI Y L， et al. Genipin is active via modulating monoaminergic transmission and levels of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in rat model of depression[J]. Neuroscience， 2014， 275（5）：365-373.

[5] 趙宏波，白曉暉，李曉娟.逍遙散治療慢性束縛應激焦慮模型大鼠行為學評價[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（5）：1669-1673.

[6] 孟? 盼，朱? 青，趙洪慶，等.甘麥大棗湯對慢性應激抑郁大鼠HPA軸及海馬顯微結構的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（6）： 581-585.

[7] 趙洪慶.焦慮性抑郁動物模型及其多層次評價體系的建立[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2017.

[8] PODOLECKI T， PUDLO R， MAZUREK M， et al. The incidence， clinical significance， and treatment effects of depression in cardiac resynchronization therapy recipients[J]. Cardiology， 2017， 183（2）：115-121.

[9] TEJEDA H A， O'DONNELL P. Amygdala inputs to the prefrontal cortex elicit heterosynaptic suppression of hippocampal inputs[J]. Journal of Neuroscience， 2014，34（43）：14365-14374.

[10] PAUL R， ALBERT， LAURA M， et al. Transcriptional Dys-regulation in Anxiety and Major Depression： 5-HT1A Gene Promoter Architecture as a Therapeutic Opportunity[J]. Current Pharmaceutical Design， 2014，20（23）： 3738-3750.

[11] MANDYAM C D. The Interplay between the Hippocampus and Amygdala in Regulating Aberrant Hippocampal Neurogenesis during Protracted Abstinence from Alcohol Dependence[J]. Front Psychiatry， 2013，27（4）：61-69.

[12] XU J Y， XU H， LIU Y， et al. Vanillin-induced amelioration of depression-like behaviors in rats by modulating monoamine neurotransmitters in the brain[J]. Psychiatry Research， 2015，225（3）：509-514.

[13] 趙洪慶，韓遠山，柳? 卓，等.焦慮性抑郁模型大鼠腦區(qū)單胺遞質含量與神經(jīng)因子表達的變化[J].中國實驗動物學報，2017，25（4）： 373-379.

[14] SINISCALCO D， GIORDANO C， ROSSI F， et al. Role of Neurotrophins in Neuropathic Pain[J]. Current Neuropharmacology， 2011， 9（4）： 523-529.

[15] 王建平，劉? 聰，楊直堂，等.白藜蘆醇對腦缺血小鼠BDNF及NT-3表達的影響[J].中國藥理學通報，2012，28（4）：531-535.

[16] JIANG P， DANG R L， LI H D， et al. The Impacts of Swimming Exercise on Hippocampal Expression of Neurotrophic Factors in Rats Exposed to Chronic Unpredictable Mild Stress[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine， 2014， 2014： 729827.