畢玉艷

七鰓鰻作為一種營(yíng)半寄生方式生存的無(wú)頜類脊椎動(dòng)物，被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物進(jìn)化的始祖，其存在至少可以追溯到3.6億年前[1～2]。自從2004年，一種新型的適應(yīng)性免疫方式在七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)后。從此各個(gè)領(lǐng)域的研究者紛紛對(duì)七鰓鰻的研究表現(xiàn)出很大的研究興趣，大量的捕撈七鰓鰻用于科學(xué)研究，據(jù)報(bào)道，隨著對(duì)于日本七鰓鰻的不斷研究，日本七鰓鰻的數(shù)量在不斷減少，如果不改變這種現(xiàn)狀，這將會(huì)成為七鰓鰻研究領(lǐng)域一項(xiàng)阻礙。本研究通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)日本七鰓鰻的鰓組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，分析七鰓鰻被刺激后精氨酸相關(guān)代謝過(guò)程的變化。發(fā)現(xiàn)在七鰓鰻中存在與精氨酸代謝有關(guān)的具有高度同源性的酶，并且發(fā)揮著哺乳動(dòng)物中相關(guān)酶相同的作用。精氨酸在日本七鰓鰻被復(fù)合抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答增加，精氨酸的存在是否對(duì)這個(gè)過(guò)程有促進(jìn)作用，有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

從黑龍江省松花江流域同江地區(qū)捕撈日本七鰓鰻，將活體日本七鰓鰻置于實(shí)驗(yàn)室水族箱中暫養(yǎng)。1 周后選取 24 條健康的個(gè)體分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。其中將實(shí)驗(yàn)組用復(fù)合抗原浸泡免疫 1 h 而后進(jìn)行免疫刺激。用0.9%NaCl溶液配制的復(fù)合抗原（滅活的啤酒酵母菌、大腸桿菌、金黃色葡萄各 1×109 個(gè)/mL），使用時(shí)稀釋至3000倍。實(shí)驗(yàn)組需要經(jīng)過(guò)隔一周一次的 2 次加強(qiáng)免疫，最后一次免疫后 3 天取其新鮮的鰓組織。而復(fù)合抗原只用于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組其他處理方式與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.1 方法

1.1.1 RNA 樣品的提取及 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序使用

用RNAiso Reagent對(duì)日本七鰓鰻復(fù)合免疫實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組鰓囊總 RNA進(jìn)行提取。將符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的總 RNA 樣本委托北京諾禾致源生物信息科技公司進(jìn)行雙向測(cè)序及分析。

1.1.2 轉(zhuǎn)錄本的拼接

先去除測(cè)序后數(shù)據(jù)中比例大于10%的含N的原始序列的讀書（N 為不能確定的堿基序列）、低質(zhì)量的讀數(shù)得到純凈讀數(shù)。運(yùn)用短序列拼接的 Trinity 軟件進(jìn)行拼接。

1.1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與注釋分析

利用 Blast 軟件，將 Unigene在 Nr 蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)。未注釋的Unigene 在 Nt 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中所搜索到的為同源序列。將 e 值（e-value）的閾值設(shè)置為小于1E-10并運(yùn)用 HMMER3 程序，根據(jù) Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中已構(gòu)建好了的蛋白結(jié)構(gòu)域 HMM統(tǒng)計(jì)模型，對(duì) Unigene 進(jìn)行注釋。

1.1.4 基因差異表達(dá)分析

以拼接得到的 Unigene 序列作為標(biāo)準(zhǔn)參考序列，應(yīng)用軟件 Bowtie將每個(gè)樣品的純凈讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)參考序列進(jìn)行比對(duì)。將Bowtie 比對(duì)的數(shù)據(jù)結(jié)果利用RSEM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)一步得到了每個(gè)樣品與每個(gè)Unigene的純凈度數(shù)數(shù)量進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)進(jìn)行 FPKM 轉(zhuǎn)換來(lái)估算基因的基因表達(dá)水平。基因差異表達(dá)的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的讀數(shù)數(shù)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 七鰓鰻鰓轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列的轉(zhuǎn)錄本拼接及注釋

對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩個(gè) cDNA 文庫(kù)進(jìn)行雙向測(cè)序分別得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，Q20和 Q30指標(biāo)分別高于 96%和 90%，因此測(cè)序結(jié)果良好。

2.2 七鰓鰻鰓組織中被復(fù)合抗原刺激后精氨酸和脯氨酸代謝有關(guān)酶的甄選

對(duì)參與精氨酸和脯氨酸代謝過(guò)程中有關(guān)酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)與精氨酸代謝通路相關(guān)度較高的5個(gè)Unigene。根據(jù)統(tǒng)計(jì)：精氨酸酶、精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、鳥氨酸脫羧酶1、胍丁胺酶的表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，精氨酸酶和肌酸激酶的表達(dá)量降低顯著。

3、討論

精氨酸能夠催化L-精氨酸水解生成鳥氨酸與尿素反應(yīng)的酶。鳥氨酸是合成多胺類物質(zhì)的前體，日本七鰓鰻機(jī)體被復(fù)合抗原刺激后精氨酸酶的表達(dá)量明顯降低，說(shuō)明抑制了精氨酸的進(jìn)一步分解為鳥氨酸，繼而阻斷了鳥氨酸循環(huán)。七鰓鰻在被復(fù)合抗原刺激后，其機(jī)體的T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答增加。肌酸激酶在精氨酸代謝途徑中是精氨酸代謝的一個(gè)中間產(chǎn)物產(chǎn)生所需要的酶，精氨酸在甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GATM）作用下生成胍基乙酸，其在胍乙酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶（GAMT）作用下生成了肌酸[5]，繼而在肌酸激酶的作用下生成磷酸肌酸。在本研究中肌酸激酶的表達(dá)量明顯降低，其抑制了肌酸的進(jìn)一步分解，而胍基乙酸可以在甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下合成精氨酸，保證了七鰓鰻在受到病原微生物侵襲時(shí)精氨酸濃度高以幫助七鰓鰻機(jī)體更快恢復(fù)正常水平。本文通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了日本七鰓鰻再被復(fù)合抗原刺激后，精氨酸代謝相關(guān)酶的表達(dá)量都呈現(xiàn)出不同程度的降低。此外，其他的研究表明，精氨酸可作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幫助動(dòng)物抗逆，那精氨酸是否能幫助七鰓鰻抗逆有待于進(jìn)一步研究。

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