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        五花茶配方優(yōu)化對發(fā)熱模型大鼠的療效及其對肝腎的影響

        2019-09-10 07:22:44甘柯林李漢成彭孝鵬
        世界中醫(yī)藥 2019年8期
        關(guān)鍵詞:模型

        甘柯林 李漢成 彭孝鵬

        摘要 目的:觀察五花茶發(fā)熱模型鼠的退熱效應(yīng),進一步明確其退熱機制,同時研究其對肝腎功能的影響。方法:將50只SPF級SD大鼠納入研究,隨機分為空白組、模型組及五花茶組。其中模型組及五花茶組利用對干酵母制備發(fā)熱模型,隨后五花茶組大鼠接受高、中、低劑量灌胃[劑量分別為6.480、3.240、1.620 g/(kg·d)],空白組及模型組接受等體積生理鹽水進行灌胃,各組均連續(xù)干預(yù)5 d,觀察各組大鼠成模后不同時間點大鼠體溫情況、干預(yù)前后大鼠肝腎功能的變化以及外周血清白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、環(huán)氧化酶1(COX-1)表達水平變化。結(jié)果:1)經(jīng)過造模后大鼠體溫明顯升高,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且體溫呈現(xiàn)出雙峰熱型,分別在術(shù)后2 h和5 h時出現(xiàn),在研究過程中部分造模大鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡、毛色暗沉,甚至出現(xiàn)寒戰(zhàn)癥狀,這提示本此造模成功。與模型組比較,五花茶組大鼠體溫明顯下降(P<0.05),且各五花茶干預(yù)組之間退熱效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2)與空白組比較,模型組與五花茶組ALT、AST、BUN、Cr差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),在五花茶干預(yù)組中,五花茶+黃芪組與五花茶+大棗組小腸推進率水平低于五花茶組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),五花茶+大棗+黃芪組小腸推進率低于其余2組患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3)與空白組比較,模型組及五花茶組大鼠IL-6、TNF-α及IL-1β均明顯升高(P<0.05),其中五花茶組上述指標(biāo)的改變較模型組明顯,其中五花茶+大棗+黃芪組改變幅度最大(P<0.05)。4)Western blotting實驗顯示:與空白組比較,模型組及五花茶組大鼠下丘腦組織COX-1明顯下降升高(P<0.05),其中五花茶組COX-1濃度有所上調(diào),各組間COX-1的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:五花茶有明顯退熱效應(yīng),具有一定的劑量依賴性,且無肝腎毒性,臨床可推廣應(yīng)用。

        關(guān)鍵詞 發(fā)熱;大鼠模型;五花茶;配方優(yōu)化;肝功能;腎功能;IL-6;TNF-α;IL-1β;COX-1

        Abstract Objective:To observe the antipyretic effect of Wuhua tea fever model rats,to further clarify its antipyretic mechanism,and to study its effect on liver and kidney function.Methods:A total of 50 SPF SD rats were randomly divided into blank group,model group and tea group.The febrile model was made by dry yeast in the model group and the Wuhua tea group,and then the rats in the Wuhua tea group were given high,middle and low doses [6.480 g/(kg·d),3.240 g/(mol·d)and 1.620 g/(mol·d)],respectively.The blank group and the model group received the same volume of normal saline for gavage.Each group was treated with continuous intervention for 5 days.The body temperature,liver and kidney function,peripheral serum interleukin-6(IL-6),tumor necrosis factor-α(TNF-α),IL-1 β,TNF-α,TNF-β,TNF-α,TNF-β in peripheral serum were observed.The expression level of cyclooxygenase 1(COX-1)changed.Results:1)After modeling,the body temperature of the rats was significantly higher than that of the blank group(P<0.05),and the body temperature showed bimodal heat type,which appeared at 2 h and 5 h after operation,respectively.In the course of the study,some of the rats showed obvious mental malaise,dark hair color,and even shivering symptoms,which indicated that the model was successful.Compared with the model group,the body temperature of rats in the Wuhua tea group decreased significantly(P<0.05),and there was no significant difference in antipyretic effect among the intervention groups(P>0.05).2)Compared with the blank group,there was no significant difference in ALT,AST,BUN and Cr between the model group and the five-flower tea group(P>0.05).In the five-flower tea dry preparation group,the intestinal propulsive rate in the five-flower tea+astragalus membranaceus group and the five-flower tea+jujube group was lower than that in the five-flower tea group.The difference was statistically significant(P<0.05).The intestinal propulsive rate of Wuhua tea+jujube+astragalus membranaceus group was lower than that of the other two groups,the difference was statistically significant(P<0.05).3)Compared with the blank group,IL-6,TNF-α and IL-1 β in the model group and the tea group were significantly increased(P<0.05),and the changes of the above indexes in the tea group were more obvious than those in the model group.The change range of Wuhua tea+jujube+astragalus membranaceus group was the largest(P<0.05).4)Western blotting test showed that compared with the blank group,the COX-1 in the hypothalamus of the model group and the tea group decreased significantly(P<0.05),and the concentration of COX-1 in the group of the five flowers tea increased significantly(P<0.05),and the concentration of MDA in the hypothalamus of the model group and the tea group increased significantly(P<0.05).There was no significant difference in OD value of COX-1 among the three groups(P>0.05).Conclusion:Wuhua tea has obvious antipyretic effect in a dose-dependent manner and has no hepatorenal toxicity.it can be popularized and applied in clinic.

        Key Words Fever;Rat model;Wuhua tea;Formula optimization;Liver function;Renal function;IL-6;TNF-α;IL-1 β;COX-1

        中圖分類號:R285.5文獻標(biāo)識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.016

        發(fā)熱是夏季風(fēng)熱感冒或流行性感冒的主要臨床表現(xiàn),五花茶是廣東傳統(tǒng)藥茶,主要由金銀花、菊花、雞蛋花、木棉花、葛花、槐花、羅漢果組成,有清熱解毒、解暑宣肺的作用[1]。有清熱燥濕的苦寒類藥物多耗氣傷陰[2-3],正如《血證論》云:“苦寒藥能大伐生氣”,我們在臨床中亦發(fā)現(xiàn)五花茶在清熱解暑的同時亦導(dǎo)致患者出現(xiàn)腸道或肝腎功能受損等毒性反應(yīng),且我們在前期篩選工作中發(fā)現(xiàn)五花茶中加入黃芪和大棗后即能保特原有作用又能減少苦寒性對腸胃、肝腎的影響,但其作用機制目前尚不明了?;诖宋覀円园l(fā)熱模型鼠為研究對象,利用五花茶加黃芪、大棗藥液進行干預(yù),以期觀察其對肝腎毒性是否減少?配方優(yōu)化是否影響五花茶的退熱作用,具體報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物 60只SPF級SD大鼠納入研究,所有動物均購自南方醫(yī)科大學(xué)[許可證號:SCXK(粵)2016-0041]。本研究最終符合實驗要求的大鼠50只納入研究,隨機分為空白組10只,造模組40只。體質(zhì)量(220±10.5)g,鼠齡(5±0.5)個月。所有動物均飼養(yǎng)于肇慶醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校動物實驗中心,飼養(yǎng)條件:溫度(22.5±1.0)℃,濕度(53±0.5)%,以12/12 h為光暗周期。本研究方案經(jīng)過肇慶醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校倫理委員會批準(zhǔn)進行。

        1.1.2 藥物 五花茶由本校中藥研究院提供,中藥組成:金銀花10 g、菊花10 g、雞蛋花10 g、木棉花10 g、葛花10 g、槐花10 g、羅漢果10 g;五花茶+黃芪組:基礎(chǔ)方+黃芪15 g;五花茶+大棗組:基礎(chǔ)方+大棗5枚。

        1.1.3 試劑與儀器 BCA試劑盒(北京索寶生物科技有限公司,批號:28392739),干酵母懸液(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司,批號:482732),IL-6試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司;批號:10923),TNF-α試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司,批號:11023),IL-1β試劑盒(購自上海廣銳生物科技有限公司,批號:17293),環(huán)氧化酶1一抗抗體(美國CST公司,批號:4841S),歐姆龍MC-347電子體溫計[歐姆龍自動化(中國)有限公司,貨號:PBA003149P]。

        1.2 方法

        1.2.1 分組與模型制備 按照參考文獻[4]中發(fā)熱模型制備方法,具體操作如下:造模前3 d對大鼠早中晚3個時間點基礎(chǔ)體溫進行測量,將單次體溫≥38 ℃且連續(xù)測量時體溫波動≥0.5 ℃的大鼠剔除。本研究最終符合實驗要求的大鼠有50只,隨機分為空白組10只,造模組40只。其中40只造模組大鼠背部皮下注射10%干酵母懸液(10 mL/kg)。注射后每1 h測量1次體溫,成模后(△T>0.8 ℃,約5 h)將大鼠隨機分為模型組及五花茶組,其中五花茶組分為高、中、低劑量組。空白組與造模組大鼠在體質(zhì)量、鼠齡等資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

        1.2.2 干預(yù)方法 五花茶組大鼠隨機分為3組,分別是五花茶組、五花茶+黃芪組、五花茶+大棗組,按大鼠與人體間等效劑量換算將劑量組3.240 mL/(kg·d),灌胃1次/d,空白組及模型組大鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃,各組均連續(xù)灌胃7 d。

        1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

        1.2.3.1 各組大鼠成模后不同時間點大鼠體溫情況 對各組大鼠進行灌胃,給藥后,每1 h測量體溫1次,連續(xù)測量6次,記錄體溫變化情況(△T=實測體溫-基礎(chǔ)體溫),同時觀察大鼠皮毛、精神狀態(tài)、飲水?dāng)z食、二便、體質(zhì)量等變化。

        1.2.3.2 各組大鼠肝腎功能的變化 干預(yù)后每組隨機選取5只大鼠,利用10%水合氯醛腹腔麻醉后取腹主動脈血,利用全自動生化分析儀對大鼠肝腎功能指標(biāo)進行檢測,肝功能:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),腎功能:尿素(BUN)、肌酐(Cr)。

        1.2.3.3 各組大鼠小腸推進率變化 干預(yù)后各組隨機選取3只大鼠,禁食12 h后用活性炭進行灌胃,隨后斷頭處死動物。剪取腸管計算小腸總長度,將幽門至活性炭前緣的長度作為腸管內(nèi)推進距離,由此計算小腸推進率。

        1.2.3.4 各組大鼠下丘腦環(huán)氧化酶1表達水平變化 干預(yù)結(jié)束后各組隨機抓取3只大鼠,利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出下丘腦組織,按照200 mg∶1 mL裂解液的比例加入適量1%PMSF的蛋白裂解液,勻漿后室溫下靜置10 min后,用BCA試劑盒測定樣本總蛋白,根據(jù)結(jié)果得出上樣量后進行電泳跑膠,轉(zhuǎn)膜,加入環(huán)氧化酶1(COX-1)及β-actin一抗,比例均按照1∶1 000稀釋,再進行生物辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的二抗孵育,最后顯影、拍攝,用Image(BIO-RAD公司)的圖像處理軟件進行處理,測定各樣本灰度值。

        1.2.3.5 各組大鼠外周血清IL-6、TNF-α、IL-1β濃度變化 收集1.2.3.2步驟中大鼠的腹主動脈血,4 ℃ 10 000 r/min下離心5 min,抽吸上清液,使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)對大鼠外周血清IL-6、TNF-α、IL-1β濃度進行檢測,具體過程如下:將樣本滴加如反應(yīng)孔中,37 ℃孵育1 h,用PBS洗滌反應(yīng)孔后每孔加入0.1 mL的酶標(biāo)抗體,37 ℃孵育30 min,在用PBS洗滌,隨后在各反應(yīng)孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液,37 ℃孵育30 min,再加入2 mol/L硫酸0.05 mL中止反應(yīng)。隨后將反應(yīng)孔板置于酶標(biāo)儀中讀取數(shù)據(jù),波長設(shè)置492 nm。操作過程全部按照試劑盒說明書進行檢測。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)如體溫、肝腎功能、COX-1、IL-6、TNF-α、IL-1β均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述,符合正態(tài)分布的采用t檢驗,不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠體溫變化情況比較 經(jīng)過造模后大鼠體溫明顯升高,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且體溫呈現(xiàn)出雙峰熱型,分別在術(shù)后2 h和5 h時出現(xiàn),在研究過程中部分造模大鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡、毛色暗沉,甚至出現(xiàn)寒戰(zhàn)癥狀,這提示本此造模成功。與模型組比較,五花茶組大鼠體溫明顯下降(P<0.05),且各五花茶干預(yù)組之間退熱效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

        2.2 各組肝腎功能及小腸推進率比較 與空白組比較,模型組與五花茶組ALT、AST、BUN、Cr差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),在五花茶干預(yù)組中,五花茶+黃芪組與五花茶+大棗組小腸推進率水平低于五花茶組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),五花茶+大棗+黃芪組小腸推進率低于其余2組小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        2.3 各組IL-6、TNF-α、IL-1β濃度比較 ELISA實驗顯示:與空白組比較,模型組及五花茶組大鼠IL-6、TNF-α及IL-1β均明顯升高(P<0.05),其中五花茶組上述指標(biāo)的改變較模型組明顯,其中五花茶+大棗+黃芪組改變幅度最大(P<0.05)。見表3。

        2.4 各組COX-1蛋白表達變化 Western blotting實驗顯示:與空白組比較,模型組及五花茶組大鼠下丘腦組織COX-1明顯下降升高(P<0.05),其中五花茶組COX-1濃度有所上調(diào),各組間COX-1的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖2。

        3 討論

        發(fā)熱是夏季風(fēng)熱感冒及流行性感冒常見的臨床表征,多數(shù)與體內(nèi)病變存在密切關(guān)注,換言之,發(fā)熱是疾病轉(zhuǎn)歸的重要信號,值得臨床重視。查閱大量文獻[5-7]顯示干酵母、LPS、2,4-二硝基酚等方法均可形成發(fā)熱模型,本研究選用干酵母作為致熱源進行發(fā)熱模型制備,結(jié)果顯示大鼠在短時間內(nèi)出現(xiàn)了體溫急劇升高,短時間內(nèi)體溫下降后又再次上升,故體溫波動趨勢形成2次熱峰,這顯示利用干酵母致發(fā)熱模型具有穩(wěn)定性、易于操作的優(yōu)點。在研究中我們發(fā)現(xiàn)接受干酵母制備發(fā)熱模型鼠機體IL-6、TNF-α及IL-1β水平出現(xiàn)明顯升高,這與國內(nèi)外諸多文獻抑制,這進一步顯示本研究造模成功。IL-6、TNF-α及IL-1β均是與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的因子,上述因子釋放后刺激巨噬細胞介導(dǎo)機體的免疫調(diào)節(jié)環(huán)節(jié),介導(dǎo)炎性反應(yīng)效應(yīng),影響下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞,從而出現(xiàn)發(fā)熱[8-10]。本研究利用Western blotting檢測各組大鼠下丘腦的COX-1水平變化,結(jié)果顯示與空白組比較,模型組及五花茶組大鼠下丘腦組織COX-1明顯下降升高(P<0.05),其中五花茶組COX-1濃度有所上調(diào),各組間COX-1的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。COX屬于膜結(jié)合蛋白,是合成前列腺素和血栓素的關(guān)鍵蛋白,是花生四烯酸代謝途中的關(guān)鍵限速酶,廣泛參與機體免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)等過程。其中COX-1是COX重要的異構(gòu)體,是COX家族重要的抗炎因子,其濃度降低意味著機體抗炎效應(yīng)減弱,故而出現(xiàn)發(fā)熱[11-12]。本研究結(jié)果顯示五花茶對發(fā)熱模型鼠有明顯退熱效應(yīng),使用五花茶后大鼠外周血IL-6、TNF-α及IL-1β水平明顯下降,COX-1表達上調(diào),這揭示五花茶退熱的主要機制與IL-6、TNF-α、IL-1β及COX-1有關(guān)。

        我們認為外邪侵襲機體皮毛,借助孔道入里,營衛(wèi)不和,正邪交織,故出現(xiàn)發(fā)熱、熱勢退而復(fù)發(fā),治療應(yīng)清熱解毒、解表宣肺。五花茶由金銀花、菊花、雞蛋花、木棉花、葛花、槐花、羅漢果組成。方中金銀花、菊花有清熱解毒、疏風(fēng)利咽之功。木棉花、葛花性均甘涼,均有清熱利濕的作用,羅漢果花性涼,味甘,歸肺、大腸經(jīng),主治清熱潤肺、止咳、利咽,諸藥合用共奏清熱解毒、解表宣肺的作用[13-14]。在臨床實踐中我們發(fā)現(xiàn)五花茶可明顯改善夏季風(fēng)熱感冒及流行性感冒的癥狀,但與此同時我們亦發(fā)現(xiàn)由于五花茶性味多苦寒涼,苦寒涼易燥濕,也就是會損傷人體津液,部分脾胃虛寒、腸胃濕滯、體質(zhì)較弱等人群服用后出現(xiàn)腹瀉等癥狀,故我們在研究中加入黃芪、大棗,結(jié)果顯示這兩味藥加入后對五花茶退熱功效并未受影響,但大鼠的小腸推進率明顯下降,這意味著加用黃芪大棗可明顯減少五花茶的胃腸道反應(yīng),但大鼠的肝腎功能并未受損,故我們認為五花茶乃至加入黃芪、大棗后用于治療夏季風(fēng)熱感冒及流行性感冒具有安全性。

        采用五花茶治療外感發(fā)熱具有積極效應(yīng),加用黃芪、大棗對配方進行優(yōu)化后既不影響藥物的功效,又可減少未嘗不良反應(yīng),具有一定的臨床優(yōu)勢。

        參考文獻

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        (2019-04-09收稿 責(zé)任編輯:王明)

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