王睿 張艷紅 胡貽椿 李敏 吳景歡 楊曉光 毛德倩

摘?要：目的：研究喂飼轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米對(duì)大鼠的亞慢性毒性。方法：選用斷乳SD大鼠140只，隨機(jī)分為7組，即3個(gè)轉(zhuǎn)基因組（72.70%、36.35%、18.18%）、3個(gè)親本玉米組（72.7%、35.35%、18.18%）、1個(gè)常規(guī)基礎(chǔ)飼料對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。動(dòng)物2只/籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，連續(xù)觀察90d。觀察大鼠體重、進(jìn)食量、血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取動(dòng)物臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果：各劑量組動(dòng)物的體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，體重增長(zhǎng)正常，中、末期的血液學(xué)和血生化指標(biāo)中個(gè)別指標(biāo)雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但并無(wú)生物學(xué)意義。各主要臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查比較，均未發(fā)現(xiàn)有生物學(xué)意義的改變。結(jié)論：現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能證實(shí)該轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米對(duì)大鼠有亞慢性毒性作用。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米;C0030.2.5基因;亞慢性毒性

轉(zhuǎn)基因玉米利用轉(zhuǎn)基因方法可以顯著提高玉米抗蟲(chóng)、抗除草劑的品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益，但這種技術(shù)是否會(huì)對(duì)人體帶來(lái)危害，是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[1-4]。本研究依據(jù)“實(shí)質(zhì)等同性”原則[5]，按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1102—2006）《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)—大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》[6]，對(duì)轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米進(jìn)行了大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，了解分析該轉(zhuǎn)基因玉米是否會(huì)對(duì)大鼠產(chǎn)生亞慢性毒性作用，為該轉(zhuǎn)基因玉米的食用飼用性安全提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品

轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米（以下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)基因玉米）、轉(zhuǎn)化受體DBN567（以下簡(jiǎn)稱親本玉米）、常規(guī)基礎(chǔ)飼料AIN-93G（以下簡(jiǎn)稱對(duì)照玉米），均為黃色籽粒;C0030.2.5、DBN567，由北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供，經(jīng)產(chǎn)品檢測(cè)后開(kāi)展本次實(shí)驗(yàn)。

1.2?材料與主要儀器

L535R湘儀低速冷凍離心機(jī)、BS-220型全自動(dòng)生化分析儀、BC-5000VET全自動(dòng)五分類血液分析儀、Leica HI1220烘片機(jī)、Leica RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Leica HI1210攤片機(jī)、Leica EG1150H型石蠟包埋機(jī)。血細(xì)胞稀釋液及溶血?jiǎng)?，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;血生化檢測(cè)試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、重慶中元生物技術(shù)有限公司。

1.3?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件

選用北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的健康SD大鼠（SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（京）2012—0001）。飼養(yǎng)地點(diǎn)：匯智泰康生物技術(shù)（北京）有限公司，級(jí)別：屏障環(huán)境，許可證號(hào)：SYXK（京）2014—0022。

1.4?飼料配制

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所對(duì)各種玉米的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行全面檢測(cè)，參照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)研究所的AIN-93G配方，在保證營(yíng)養(yǎng)平衡的基礎(chǔ)上計(jì)算轉(zhuǎn)基因玉米能摻入飼料的最大比例。經(jīng)計(jì)算得出各玉米在飼料中的最大摻入量為72.70%，以此作為高劑量，中、低劑量的玉米摻入量分別設(shè)為35.35%、18.18%。以上飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司制備。配制好的飼料輻照滅菌后真空包裝保存供實(shí)驗(yàn)使用。

1.5?實(shí)驗(yàn)方法

選用斷乳SD大鼠140只，隨機(jī)分為7組，即C0030.2.5低、中、高劑量組（以下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)低、轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)高），轉(zhuǎn)化受體玉米DBN567低、中、高劑量組（以下簡(jiǎn)稱親低、親中、親高），AIN-93G（以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組）。每組20只，雌雄各半。動(dòng)物2只/籠喂養(yǎng)，自由飲食，每周稱量1次大鼠體重，每周記錄1次給食量和剩食量，連續(xù)觀察90d。各組于實(shí)驗(yàn)中期和末期分別采血測(cè)定各項(xiàng)血液學(xué)、血生化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取動(dòng)物臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.6?觀察指標(biāo)

1.6.1?動(dòng)物的一般表現(xiàn)、體重、食物利用率?每周稱量1次大鼠體重，記錄1次給食量和剩食量。計(jì)算食物利用率：

食物利用率=實(shí)驗(yàn)期內(nèi)動(dòng)物體重增加（g）/實(shí)驗(yàn)期內(nèi)動(dòng)物總進(jìn)食量（g）×100%（1）

1.6.2?血液學(xué)檢查?分別于實(shí)驗(yàn)中期和末期對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中紅細(xì)胞（RBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）量、血小板（PLT）數(shù)、白細(xì)胞（WBC）數(shù)及其分類（中性、淋巴、單核）進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中期大鼠眼內(nèi)眥取血，實(shí)驗(yàn)結(jié)束大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血。

1.6.3?臨床生化學(xué)檢查?實(shí)驗(yàn)中期和末期動(dòng)物空腹采血進(jìn)行血液生化指標(biāo)測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)為總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（ALP）。

1.6.4?臟體比?實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物取肝、腎、腎上腺、脾、胸腺、心臟、睪丸稱重，計(jì)算相應(yīng)的臟體比（以百克體重計(jì)算）。

1.6.5?病理組織學(xué)?解剖進(jìn)行大體觀察及組織病理學(xué)檢查。組織病理學(xué)檢查組分別為C0030.2.5高劑量組、對(duì)照玉米DBN567高劑量組、AIN-93G，檢查組織有腦、心臟、肺、肝、腎、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢和子宮。

1.7?統(tǒng)計(jì)方法

轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米低、中、高劑量組與相應(yīng)劑量的轉(zhuǎn)化受體DBN567組和AIN-93G對(duì)照組比較，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），方差齊時(shí)采用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果與分析

2.1?生長(zhǎng)狀況及食物利用率

對(duì)照組中有1只雌性動(dòng)物在第9周意外死亡，大體解剖臟器未見(jiàn)異常，該組其他動(dòng)物以及其余各組動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間活動(dòng)、生長(zhǎng)正常，被毛濃密有光澤。雄、雌性大鼠C0030.2.5各劑量組與相應(yīng)劑量的親本玉米DBN567組相比較，體重未見(jiàn)顯著差異（表1）。雄性大鼠轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)低組總進(jìn)食量低于相應(yīng)劑量的親本組（P<0.05），雄性大鼠轉(zhuǎn)高組總食物利用率高于親高組（P<0.05），其余各劑量組雌、雄動(dòng)物的總增重、總進(jìn)食量以及總食物利用率未見(jiàn)顯著差異（P>0.05）（表2）。與對(duì)照組相比，雄性大鼠轉(zhuǎn)高、轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)低組和親高、親中、親低組體重（表1）均有顯著性增加（P<0.05），尤其在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢凇Ｐ坌源笫筠D(zhuǎn)高組總食物利用率高于對(duì)照組（P<0.05）（表2），雄性大鼠3個(gè)親本組及轉(zhuǎn)高組體重增重和總進(jìn)食量、轉(zhuǎn)低組體重增重、轉(zhuǎn)高組總食物利用率均高于對(duì)照組（P<0.05）。其余各雌、雄大鼠體重增重、總進(jìn)食量、總食物利用率在各玉米摻飼劑量組和對(duì)照組之間未見(jiàn)顯著差異（P>0.05）（表2）。

2.2?血液學(xué)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)中期，雄性大鼠親高組、轉(zhuǎn)高組中性粒細(xì)胞顯著降低（P<0.05）;親高組、親低組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)中組淋巴細(xì)胞水平顯著增高（P<0.05）;轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)中組單核細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.05）。在雌性大鼠中，親低組RBC水平顯著升高而WBC水平顯著降低（P<0.05），轉(zhuǎn)低組RBC與親本組比較顯著降低（P<0.05）（表3）。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，親高組1只雌性大鼠、轉(zhuǎn)高組2只雄性大鼠樣本出現(xiàn)凝血，對(duì)照組中1只雌性大鼠在第9周意外死亡，檢測(cè)結(jié)果未納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。與相應(yīng)劑量的親本組比較，雄性大鼠轉(zhuǎn)高組WBC、轉(zhuǎn)中組中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞水平顯著降低（P<0.05）;與對(duì)照組相比，雄性大鼠親高組WBC水平顯著升高，親中組、親低組中性粒細(xì)胞顯著升高，親中組、轉(zhuǎn)低組淋巴細(xì)胞水平顯著降低，親低組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)低組PLT數(shù)顯著降低（P<0.05）;雌性大鼠轉(zhuǎn)中組血紅蛋白顯著升高，親低組、轉(zhuǎn)低組PLT數(shù)顯著升高（P<0.05）（表4）。由表3～4可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)中期或末期有個(gè)別指標(biāo)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，或盡在實(shí)驗(yàn)中期出現(xiàn)，或未呈現(xiàn)劑量—反應(yīng)關(guān)系，且均在該品系動(dòng)物正常值范圍內(nèi)[7-8]，認(rèn)為無(wú)生物學(xué)意義。其余各組各指標(biāo)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)基因其余各組各項(xiàng)指標(biāo)與其相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3?血生化指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)中期，與對(duì)照組相比，雄性大鼠3個(gè)親本組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)中組ALT水平顯著升高（P<0.05）;轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組、親本各劑量組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組、轉(zhuǎn)中組GLU水平顯著升高、TC水平顯著降低（P<0.05）;親中組、轉(zhuǎn)中組、轉(zhuǎn)低組UREA水平顯著降低（P<0.05）;親高組、轉(zhuǎn)高組LDH水平顯著增高（P<0.05）。在雌性大鼠中，親高組、親中組、轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組ALT水平顯著升高（P<0.05）;親高組、親低組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)低組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組、轉(zhuǎn)中組、轉(zhuǎn)低組UREA水平顯著降低（P<0.05）;親高組LDH水平顯著增高（P<0.05）（表5）。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，與相應(yīng)劑量的親本組比較，雄性大鼠轉(zhuǎn)低組ALT、AST水平和轉(zhuǎn)中組TP、GLU水平顯著升高（P<0.05）。與對(duì)照組相比，雄性大鼠親高組、轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組ALT水平顯著升高（P<0.05）;轉(zhuǎn)低組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組TP、ALB、GLU水平顯著降低（P<0.05）。在雌性大鼠中，親高組、親中組、轉(zhuǎn)低組AST水平顯著增高（P<0.05）（表6）。由表5～6可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)中期與末期轉(zhuǎn)基因組和親本組有個(gè)別指標(biāo)與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系且變化均在該品系動(dòng)物正常值范圍內(nèi)[8-10]，認(rèn)為無(wú)生物學(xué)意義。其余各組各指標(biāo)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)基因其余各組各項(xiàng)指標(biāo)與其相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4?大鼠臟體比

實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)各劑量組的臟器重量稱重，并計(jì)算臟體比。雄性大鼠親低組、轉(zhuǎn)低組肝臟臟體比顯著升高（P<0.05），親高、轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組的腎臟臟體比顯著降低（P<0.05），親高組、親中組、轉(zhuǎn)低組腎上腺臟體比顯著降低（P<0.05），其余各組大鼠臟體比與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。轉(zhuǎn)基因各劑量組臟體比與相應(yīng)親本組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表7）。

2.5?大體病理及組織學(xué)檢查

各組大鼠外觀、皮膚未見(jiàn)異常，胸、腹腔膜未見(jiàn)出血點(diǎn)、積液，主要臟器正常，未見(jiàn)明顯病理病變。對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、親本玉米以及AIN-93G對(duì)照組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查，未見(jiàn)與受試物有關(guān)的特異性毒性病理改變。

3?討論

本研究將轉(zhuǎn)基因玉米及其親本對(duì)照分別摻入飼料給予大鼠90d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄性、雌性大鼠轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照玉米組相比較，體重、體重增長(zhǎng)、周攝食量、對(duì)周食物利用度雖有個(gè)別統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異，但在歷史對(duì)照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，且總體重增加、總進(jìn)食量和總食物利用率未見(jiàn)顯著差異。實(shí)驗(yàn)中期和末期各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)和血生化指標(biāo)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照玉米組相比較，有個(gè)別指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但大部分有差異的指標(biāo)沒(méi)有同時(shí)與2個(gè)對(duì)照組都存在差異或沒(méi)有同時(shí)在雌雄大鼠中存在差異，且基本上都在文獻(xiàn)報(bào)道的正常范圍之內(nèi)[5-10]，且未出現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

臟器重量變化可轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與其相應(yīng)劑量的親本對(duì)照相比較，臟器重量和臟體比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)7組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查，未見(jiàn)與受試物有關(guān)的特異性毒性病理改變。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中會(huì)受轉(zhuǎn)基因食品特性外的一些不確定因素的影響[11]，因此認(rèn)為這些差異有可能與大鼠個(gè)體差異有關(guān)，而不應(yīng)認(rèn)為指標(biāo)升高是因飼喂轉(zhuǎn)基因飼料造成的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)具有對(duì)大鼠有生物學(xué)意義的亞慢性毒性作用。本研究還將開(kāi)展急性毒性實(shí)驗(yàn)、多代繁殖實(shí)驗(yàn)、營(yíng)養(yǎng)功效等研究，以更好地評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性。

參考文獻(xiàn)

[1]郭紅衛(wèi).轉(zhuǎn)基因食品的安全性評(píng)價(jià)概況[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，13（4）：153-155.

[2]農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)指南[S].2006：6.

[3]張力，程呈，何寧，等.轉(zhuǎn)基因高油酸大豆對(duì)大鼠的亞慢性毒性研究[J].毒理學(xué)雜志，2011，25（5）：391-394.

[4]張力，王靜，姜淑卿，等.轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry2Aj 和G10evo（EPSPS）基因抗蟲(chóng)耐草甘膦玉米對(duì)大鼠的亞慢性毒性研究[J].環(huán)境與健康雜志，2016，33（7）：585-589.

[5]WHO.Application of the principles of substantial equivalence to the safety evaluation of food components from plants derived by modern biotechnolog[R].Geneva：WHO，1995：11.

[6]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)——大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[S].北京：中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2006.

[7]田輝，樊柏林.SPF級(jí)Wistar大鼠血液學(xué)及生化指標(biāo)正常值范圍探討[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2007，24（2）：23-24.

[8]蔣中仁，徐薇，金偉，等.SD大鼠血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)及臟體比正常值范圍探討[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2011，27（10）：789-791.

[9]齊云，蔡潤(rùn)蘭，劉彬，等.新藥長(zhǎng)毒試驗(yàn)動(dòng)物血液生化測(cè)定規(guī)范化研究系列之五[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（4）：193-196.

[10]朱華，高虹，黃瀾，等.清潔級(jí)SD大鼠標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)指標(biāo)的建立[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2005，21（9）：629-633.

（責(zé)任編輯?唐建敏）