付萍 何健龍 張秀珍 姜會(huì)超 劉愛(ài)英 程玲 于廣磊 宋秀凱

摘要：為防范滸苔綠潮次生災(zāi)害和降低海水養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，文章采用人工授精的太平洋牡蠣胚胎、不同相對(duì)濃度的滸苔腐爛液以及基于發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析滸苔腐爛液的生物毒性及其對(duì)太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果表明：隨著滸苔腐爛液相對(duì)濃度的提高，太平洋牡蠣D形幼蟲(chóng)相對(duì)孵化率逐漸降低至0，滯育和畸形等非正常胚胎增多，囊胚-原腸期和擔(dān)輪幼蟲(chóng)期占比降至極低，易發(fā)生卵膜破裂和卵裂球分散，這些與太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的階段特點(diǎn)和滸苔腐爛液生物毒性的作用機(jī)制等有關(guān);滸苔腐爛液相對(duì)濃度（0.25～10 g/L）與生物毒性呈顯著正相關(guān)，生物毒性（10%～97%）與相對(duì)孵化率呈顯著負(fù)相關(guān)，且生物毒性達(dá)重毒水平時(shí)（由56%至70%）相對(duì)孵化率大幅下降（由66%至18%）;建議在太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的相對(duì)孵化率為50%時(shí)發(fā)出滸苔綠潮的漁業(yè)高風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，對(duì)應(yīng)的滸苔腐爛液相對(duì)濃度為4.6 g/L、生物毒性為55%。

關(guān)鍵詞：綠潮;生物毒性;相對(duì)孵化率;海洋貝類(lèi);海水養(yǎng)殖

Abstract：To prevent the secondary toxic hazard of Ulva prolifera Green tide and reduce the risk of mariculture，the biotoxicity of U.prolifera decomposing solution and its effect on the embryonic development of Crassostrea gigas were studied.The fertilized eggs within 1 h after fertilization were taken as the experiment subjects while determining the biotoxicity by luminous bacteria method.The results showed that the biotoxicity was obviously increased with increasing decomposing solution concentration.At the same time，diapauses and deformities were more serious and the relative hatching rate was decreased gradually.The higher the concentration of decomposing solution was，the higher risk of egg membrance ruptured and blastomere scattered.They were related to the characteristics of embryonic development of C.gigas and the effect of secondary toxicity caused by decomposing solution.There was a significant positive correlation between the relative concentration of U.prolifera decomposing solution （0.25 to 10 g/L） and the biotoxicity，and a strong negative correlation between the biotoxicity （10% to 97%） and the relative hatching rate.When the biotoxicity increased from 56% to 70%，the relative hatching rate decreased from 66% to 18%.In order to effectively prevent the secondary toxicity caused by U.prolifera decay，it is suggested to take the 50% relative hatching rate of C.gigas as the warning value，when the corresponding concentration was 4.6 g/L and the biotoxicity was 55%.

Key words：Green tide，Biotoxicity，Relative hatching rate，Marine bivalve，Mariculture

0 引言

綠潮是有害的藻華現(xiàn)象，通常發(fā)生在富營(yíng)養(yǎng)化程度較高的水域環(huán)境，其中黃海綠潮的主要藻種為滸苔（Ulva prolifera）[1]。滸苔腐爛分解可產(chǎn)生毒性，嚴(yán)重影響海洋生物的生長(zhǎng)發(fā)育，給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大風(fēng)險(xiǎn)[2]。太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）是全球牡蠣養(yǎng)殖規(guī)模最大和產(chǎn)量最高的品種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)是良好的海水環(huán)境指示生物[3]。

目前鮮有滸苔次生毒性對(duì)太平洋牡蠣胚胎發(fā)育影響的研究，其危害尚不明確。由于滸苔濕重計(jì)量的誤差較大及其腐爛程度不易掌控，本研究采用靈敏度較高的基于發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)法[4]，可表征滸苔腐爛液的生物毒性，并初步分析其與太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的相關(guān)性，為科學(xué)規(guī)避海水養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)和評(píng)估綠潮災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2018年7月13日自山東省威海市乳山市近岸海域挑選性腺成熟度好的太平洋牡蠣親貝雌貝和雄貝各2個(gè)，以人工授精的方式獲得其受精卵：將雌貝和雄貝的性腺分別解剖置于裝有自然海水的燒杯中，以200目篩絹過(guò)濾雜質(zhì)，取2 mL精液加入卵子懸浮液，經(jīng)玻璃棒攪拌后用顯微鏡計(jì)數(shù)，將加入精液的時(shí)間視為受精時(shí)間。于乳山市近岸海域采集滸苔并冰凍備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)取出，按50 g/L的濃度比例放入裝有自然海水的5 L錐形瓶，置于黑暗環(huán)境，在腐爛發(fā)酵5 d后經(jīng)JP80篩絹過(guò)濾，制成滸苔腐爛液母液。其他主要儀器和試劑包括Delta Tox Ⅱ便攜式生物毒性分析儀（SDI公司）、顯微鏡（Olympus DP80）、發(fā)光細(xì)菌凍干粉-費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri，NRRL B-11177）和Microtox稀釋劑。

采用250 mL樣品瓶，分別獨(dú)立暴露不同濃度的滸苔腐爛液：實(shí)驗(yàn)組按兩端等比和中間等差倍數(shù)添加滸苔腐爛液，每組試液容量為200 mL，并換算相對(duì)濃度，共設(shè)置10個(gè)濃度梯度和1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)平行。采用便攜式生物毒性分析儀檢測(cè)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組滸苔腐爛液的生物毒性[5]，并采用發(fā)光強(qiáng)度衰減量表征（表1）。

在各實(shí)驗(yàn)組放入等量（約800粒）太平洋牡蠣受精卵，采用半靜水生物實(shí)驗(yàn)方法，每1 h通過(guò)一次性吸管手動(dòng)吹氣30 s，實(shí)驗(yàn)用海水溫度為（23±1）℃、鹽度為31.5。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行22 h后用盧戈氏碘液固定胚胎，采用顯微鏡觀察和記錄其發(fā)育階段的數(shù)量。太平洋牡蠣胚胎發(fā)育分為細(xì)胞期、囊胚期、原腸期、擔(dān)輪幼蟲(chóng)期和D形幼蟲(chóng)期，由于囊胚期和原腸期的胚胎固定后于顯微鏡下難以區(qū)分，二者合并計(jì)數(shù)。

采用相對(duì)孵化率計(jì)算太平洋牡蠣胚胎發(fā)育至D形幼蟲(chóng)的占比，即實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組太平洋牡蠣胚胎發(fā)育至D形幼蟲(chóng)的占比之比。采用Excel和SPSS軟件統(tǒng)計(jì)D形幼蟲(chóng)相對(duì)孵化率和胚胎各發(fā)育階段占比等數(shù)據(jù)，采用Origin 7.5軟件進(jìn)行滸苔腐爛液相對(duì)濃度、生物毒性和相對(duì)孵化率的線性擬合。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

太平洋牡蠣受精卵在自然海水中孵化22 h后可發(fā)育至D形幼蟲(chóng)。滸苔腐爛液生物毒性對(duì)其胚胎發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖1所示。

2.1 主要影響

太平洋牡蠣的卵子在組織中被擠壓呈梨形，在海水中懸浮后逐漸呈圓形，受精后表面更加光滑圓潤(rùn)，直徑約為50 μm（圖1（a））。隨著滸苔腐爛液相對(duì)濃度（母液占比）的提高，太平洋牡蠣胚胎發(fā)育受到不同程度的影響，主要包括4個(gè)方面。

（1）D形幼蟲(chóng)相對(duì)孵化率逐漸降低，且滸苔腐爛液相對(duì)濃度為32%時(shí)，已觀察不到D形幼蟲(chóng)。

（2）滯育和畸形等非正常胚胎增多（圖1（b）～（h）），而正常D形幼蟲(chóng)減少（圖1（i））。

（3）細(xì)胞期占比顯著提高，而D形幼蟲(chóng)期占比顯著降低：相對(duì)濃度為0～4 g/L時(shí)，D形幼蟲(chóng)期占比最高，其次是細(xì)胞期，中間階段占比較低;相對(duì)濃度自6 g/L開(kāi)始，細(xì)胞期占比極高，其次是D形幼蟲(chóng)期，中間階段占比極低;相對(duì)濃度達(dá)到2 g/L時(shí)，已觀察不到擔(dān)輪幼蟲(chóng)。

（4）低濃度滸苔腐爛液易造成胚胎滯育和畸形，但細(xì)胞間隙較緊密（圖1（b）～（d））;而高濃度滸苔腐爛液易造成卵膜破裂和卵裂球分散（圖1（e）～（g）），出現(xiàn)較多胚胎殘?jiān)?/p>

本研究人工授精的太平洋牡蠣胚胎在自然海水中發(fā)育成D形幼蟲(chóng)的占比為81%，有研究表明自然受精的太平洋牡蠣胚胎孵化率更高[7-8]。高濃度滸苔腐爛液中囊胚-原腸期和擔(dān)輪幼蟲(chóng)期占比極低，可能是由于卵膜破裂發(fā)生在囊胚-原腸期[9]：在囊胚-原腸期前，卵膜對(duì)胚胎抵抗不利的外界環(huán)境起到重要的保護(hù)作用;在擔(dān)輪幼蟲(chóng)期后，D形幼蟲(chóng)開(kāi)始從外界攝食，機(jī)體免疫力增強(qiáng)，適應(yīng)外界環(huán)境的能力也逐漸提高;而囊胚-原腸期和擔(dān)輪幼蟲(chóng)期的胚胎既沒(méi)有卵膜保護(hù)，又無(wú)法攝食（有研究表明擔(dān)輪幼蟲(chóng)期胚胎的防御相關(guān)酶活性較低[10]）。因此，太平洋牡蠣胚胎在囊胚-原腸期和擔(dān)輪幼蟲(chóng)期對(duì)外界環(huán)境的敏感度較高，度過(guò)該敏感期即可較順利地發(fā)育成D形幼蟲(chóng)。此外，高濃度滸苔腐爛液中胚胎除滯育和畸形程度更高外，卵裂球分散和卵膜破裂現(xiàn)象較明顯，可能是生物毒性越強(qiáng)，越易破壞卵膜和分解細(xì)胞組織間隙物質(zhì)。

滸苔腐爛液相對(duì)濃度越高，殼緣和絞合線內(nèi)凹以及外殼不完整的非正常D形幼蟲(chóng)（圖1（h））越多，可能是由于滸苔腐爛分解產(chǎn)生的大量CO2溶于水，影響貝殼的形成。Kurihara等[11-12]研究CO2酸化海水對(duì)太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)海水pH值的降低嚴(yán)重影響貝殼鈣化，這種損害可能同時(shí)存在合成和分解，還會(huì)影響其他海洋生物的鈣化;海水pH值的降低還會(huì)加強(qiáng)H2S氣體的毒性，藻類(lèi)腐爛分解過(guò)程中產(chǎn)生的H2S氣體[13]在酸性水體中的毒性甚至強(qiáng)于氨氮[14]。此外，大型藻類(lèi)腐爛分解還易造成海水缺氧，導(dǎo)致海洋生物受損甚至死亡。

目前滸苔腐爛液中的有毒成分尚不明確[15]。Quinlan等[16]提出腐爛的褐藻會(huì)釋放大量有毒物質(zhì)，并認(rèn)為波羅的海鯡魚(yú)卵的大量死亡可能與褐藻腐爛分解過(guò)程中釋放的毒性水溶溢出液有關(guān);王超[17]發(fā)現(xiàn)滸苔腐爛液對(duì)海洋浮游生物和貝類(lèi)均有明顯的毒性作用。

2.2 線性相關(guān)

自然海水為無(wú)毒。隨著相對(duì)濃度的提高，滸苔腐爛液的生物毒性逐漸加強(qiáng)：相對(duì)濃度為0.25 g/L和0.5 g/L時(shí)為微毒，相對(duì)濃度為1 g/L和2 g/L時(shí)為中毒，相對(duì)濃度為4 g/L和6 g/L時(shí)為重毒，相對(duì)濃度為8 g/L及以上時(shí)為劇毒;相對(duì)濃度為10 g/L時(shí)迅速升至97%，相對(duì)濃度為16 g/L及以上時(shí)達(dá)最大值99%。經(jīng)線性擬合，滸苔腐爛液相對(duì)濃度為0.25～10 g/L時(shí)，與生物毒性呈顯著正相關(guān)，表明生物毒性可較好地表征相對(duì)濃度（圖2）。

隨著滸苔腐爛液生物毒性的加強(qiáng)，相對(duì)孵化率逐漸降低，表明胚胎發(fā)育受到明顯抑制和損害。當(dāng)生物毒性達(dá)重毒水平時(shí)（由56%至70%），相對(duì)孵化率大幅下降（由66%至18%），毒害效應(yīng)顯著。經(jīng)線性擬合，滸苔腐爛液生物毒性為10%～97%時(shí)，其與相對(duì)孵化率呈顯著負(fù)相關(guān)（圖3）。

3 結(jié)語(yǔ)

滸苔腐爛液生物毒性對(duì)太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的影響存在閾值，即滸苔腐爛液超過(guò)一定的相對(duì)濃度時(shí)，其生物毒性對(duì)太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的影響極為顯著。為更好地防范滸苔綠潮次生災(zāi)害，建議在太平洋牡蠣胚胎發(fā)育的相對(duì)孵化率為50%時(shí)發(fā)出滸苔綠潮的漁業(yè)高風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，對(duì)應(yīng)的滸苔腐爛液相對(duì)濃度為4.6 g/L、生物毒性為55%。

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