李亞梅 彭壯 徐佳 張智敏 林麗美 夏伯候 廖端芳

〔摘要〕 目的 應用網(wǎng)絡藥理學方法預測夏枯草抗乳腺癌的作用靶點及相關信號通路，挖掘其抗乳腺癌的作用機制。方法 在TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索并篩選出夏枯草的潛在活性成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢活性成分作用靶點并采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡圖;在HPO和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索乳腺癌相關基因;將活性成分作用靶點和乳腺癌相關基因進行比對，得到重復項（即活性抗乳腺癌的可能靶點）;利用String平臺構(gòu)建潛蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）;使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建夏枯草潛在活性成分-靶點-乳腺癌網(wǎng)絡，并根據(jù)度值、介數(shù)和緊密度篩選出關鍵靶點;應用Metascape數(shù)據(jù)庫分析關鍵靶點的KEGG信號通路并進行GO生物過程富集。結(jié)果 夏枯草中有19種活性成分，作用于253個靶點;夏枯草有17種成分可作用于乳腺癌相關的29個靶點，其中有7個關鍵靶點，7種主要活性成分，9條相關信號通路。結(jié)論 夏枯草可通過雌激素受體、細胞特異性周期蛋白、表皮生長因子受體等靶點及相關通路，發(fā)揮抗乳腺癌作用。

〔關鍵詞〕 夏枯草;乳腺癌;網(wǎng)絡藥理學;活性成分

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.021

〔Abstract〕 Objective To predict the anti-breast cancer target and related signaling pathways， and explore the anti-breast cancer mechanism of Prunella Vulgaris L. by network pharmacology. Methods The potential active ingredients of Prunella vulgaris L. were searched and screened in the TCMSP and TCMID databases. The targets of potential active ingredients were searched in the TCMSP database， and Cytoscape 3.7.1 software was used to construct active ingredients-target network map. The breast cancer related genes were searched in the HPO and DisGe NET databases. Comparing the target of active ingredients of breast cancer-related genes to get duplicates （i.e. possible targets of active anti-breast cancer）. The potential protein interaction network （PPI） was constructed by using the String platform. The cytoscape 3.7.1 software was used to construct a potential active component-target-breast cancer network of Prunella vulgaris L.， and screen out the key targets based on the median of degree， betweenness and closeness. Metascape database was applied to analyze KEGG signaling pathways of key targets and perform GO biological processes enrichment. Results There were 19 active components in Prunella vulgaris L.， which acted on 253 targets， and it had 17 components that acted on 29 targets associated with breast cancer， 7 key targets， 7 main active ingredients， and 9 related signaling pathways. Conclusion Prunella vulgaris L. can play the anti-breast effect through estrogen receptor， G1/S-specific cyclin-D1， epidermal growth factor receptor and some correlation signaling pathway.

〔Keywords〕 Prunella vulgaris L; breast cancer; network pharmacology; active ingredients

夏枯草，唇形科夏枯草屬植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥成熟果穗[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性寒，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫之功，用于目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳癖和乳房脹痛等;《本草從新》有夏枯草“治瘰疬、鼠瘺、癭瘤、癥堅、乳癰、乳巖”的記載;《本草經(jīng)疏》載“治乳癰，乳巖。”可見古人已對夏枯草用于治療乳腺疾病有較深的研究。

近年來，夏枯草化學成分、藥理機制及臨床應用的研究很多[2-3]，目前已從夏枯草植物中分離得到約200個化合物，其中大部分為三萜、甾醇和黃酮類化合物，其次為香豆素、苯丙醇、多糖和揮發(fā)油[4];夏枯草具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗甲狀腺腫、護肝等廣泛的藥理作用[5-9];在臨床上，夏枯草用于乳腺增生、高血壓等[10]。但整體系統(tǒng)地分析其成分、靶點、通路和疾病的相互關系未見報道。網(wǎng)絡藥理學[11]、整合藥理學[12]等概念的相繼提出，以及生物信息學、分子生物學、計算機技術的不斷發(fā)展和聯(lián)合應用，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供了新的研究思路與方法[13-14]，采用整合生物信息學、分子生物學及各大相關數(shù)據(jù)庫信息，系統(tǒng)地研究“藥物-靶點-通路-疾病”之間相互作用，探究中醫(yī)藥“多成分、多靶點、多途徑”藥理機制，與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論治、組方配伍、協(xié)同增效等原則不謀而合[15]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法，探索夏枯草的主要物質(zhì)基礎、核心靶點及與疾病之間的相互關系，為進一步闡明夏枯草抗乳腺癌作用機制提供思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 ?所需數(shù)據(jù)庫和軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）;TCMID數(shù)據(jù)庫（http：//119.3.41.228/tcmid/search/）;STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/）;STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）;Cytoscape 3.7.1軟件;Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;HPO數(shù)據(jù)庫（https：//hpo.jax.org/app/）;DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）;Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）;TTD數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）;UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）;Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）;KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg/）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?夏枯草活性成分檢索與篩選 ?在TCMSP數(shù)據(jù)庫（中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）查詢夏枯草成分，依據(jù)藥物ADME（吸收、分布、代謝及排泄）特性，且參照多篇文獻標準，將數(shù)據(jù)庫中的口服利用度（OBioavail， OB）和類藥性（drug-likeness， DL）作為篩選的關鍵參數(shù)[16]，夏枯草化學成分中滿足OB>30%且DL>0.18的化合物作為活性成分。此外，藥物口服利用度低的可做成其他劑型，因此，通過TCMID數(shù)據(jù)庫和文獻檢索，補充夏枯草中的其他有效成分。將篩選出的夏枯草有效成分在Pubchem數(shù)據(jù)庫中查詢其結(jié)構(gòu)式，并采用SMILES表達式。

1.2.2 ?夏枯草活性成分靶點挖掘 ?通過TCMSP靶點查詢夏枯草活性成分的作用靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將查詢到的靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。采用Cytoscape 3.7.1對夏枯草活性成分和作用靶點進行相關網(wǎng)絡構(gòu)建。

1.2.3 ?疾病相關基因檢索 ?在HPO數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索乳腺癌（breast cancer）的靶基因，去除重復項，并查閱乳腺癌靶基因的相關文獻[17]，匯總?cè)橄侔┌谢?。并在UniProt數(shù)據(jù)庫中進行基因和蛋白的轉(zhuǎn)換。

1.2.4 ?蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建 ?將“1.2.2”和“1.2.3”項得到的靶點進行比對，找出重復的靶點，將這些重復靶點導入到STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”（智人）進行操作，最低相互作用閥值設為中等“medium confidence=0.4”，構(gòu)建靶點群蛋白互作網(wǎng)絡（protein protein interaction network， PPI network）[18]，即“夏枯草-靶點-乳腺癌”網(wǎng)絡。

1.2.5 ?關鍵靶點的篩選 ?應用Cytoscape 軟件的對PPI 網(wǎng)絡進行拓撲屬性分析，計算網(wǎng)絡整體的“節(jié)點度值分布（Node Degree Distribution）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）”，以Degree、Betweenness和Closeness的均數(shù)為“閾值”，選取Degree、Betweenness和Closeness同時在閾值之上的靶點為“關鍵靶點”，研究關鍵靶點可能的藥理作用。

Degree反映了網(wǎng)絡節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)目;Betweenness是網(wǎng)絡中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑數(shù)目與最短路徑總數(shù)之比;Closeness是通過節(jié)點間的傳遞距離來對節(jié)點的重要度進行衡量。Degree、Betweenness和Closeness是衡量一個節(jié)點在網(wǎng)絡中重要性的主要拓撲參數(shù)，也是判斷一個靶蛋白是否為“關鍵靶點”的重要依據(jù)[19]。

1.2.6 ?關鍵靶點的代謝通路與生物過程分析 ?為進一步研究夏枯草抗乳腺癌的作用情況，采用Metascape平臺對夏枯草的抗乳腺癌靶點群進行KEGG代謝通路富集分析，研究夏枯草靶點的主要抗乳腺癌代謝通路;再進行GO生物過程富集分析，詮釋夏枯草靶點的抗乳腺癌生物過程，Metascape平臺列表與背景均設置“Homo Sapiens”（人類）進行操作。

2 結(jié)果

2.1 ?夏枯草活性成分

如表1所示，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共挖掘到夏枯草活性成分11個，通過TCMID數(shù)據(jù)庫和文獻檢索得到8個活性成分。

2.2 ?夏枯草活性成分靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢夏枯草活性成分靶點得到，19種夏枯草活性成分的靶點數(shù)分別為：M1， 37個;M2，63個;M3，3個;M4，31個;M5，8個;M6，57個;M7，2個;M8，2個;M9，2個;M10，17個;M11，149個;M12，1個;M13，55個;M14，33個;M15，9個;M16，6個;M17，21個;M18，6個;M19，45個。

去除重復項和非人種屬靶點，19種活性成分共作用于253個靶點。

如圖1 所示，通過Cytoscape 3.7.1軟件得到夏枯草活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡圖，19個菱形表示夏枯草的活性成分（M1-M19代表的化合物見表1），253個不規(guī)則四邊形為活性成分作用靶點，共有540條邊代表靶點和化學成分之間的相互作用，體現(xiàn)了夏枯草多成分、多靶點的特點。

2.3 ?乳腺癌相關基因

在HPO數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索乳腺癌（breast cancer）的靶基因，共得到256個基因，其中HPO中檢索到23個基因，DisGeNET中檢索到253個，有20個重復。

2.4 ?蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建圖

在HPO數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索乳腺癌（breast cancer）的靶基因與夏枯草作用的靶基因有29個重復，這29個靶基因可能為夏枯草抗乳腺癌的靶點。為研究各靶點在體內(nèi)的相互作用關系，尋找核靶點，將潛在靶點蛋白群進行PPI 網(wǎng)絡分析（見圖2），結(jié)果共發(fā)現(xiàn)29個靶蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生220條代表蛋白之間相互作用的邊。

2.5 ?核心靶點分析結(jié)果

Cytoscape計算得到，PPI 網(wǎng)絡平均度值為13.11，平均介數(shù)為2.18×10-2，平均緊密度為0.56，度值、介數(shù)和緊密度均超過平均值的靶蛋白共7個，說明以上7個靶點在PPI 網(wǎng)絡中處于關鍵位置，很可能是夏枯草抗乳腺癌的關鍵靶點（圖3）。此外，發(fā)現(xiàn)夏枯草的19種活性成分中的17種活性成分可能有抗乳腺癌的作用，且其中M1、M2、M6、M10、M11、M13、M19這7種活性成分可能是抗乳腺癌的關鍵化合物。見圖4和表2。

2.6 ?Metascape分析的KEGG和GO 結(jié)果

按照P值（校正）<0.01的標準，運用Metascape數(shù)據(jù)庫對7個關鍵靶點計算分析，得到關鍵靶點的相關通路信息。包括乳腺癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路、膀胱癌通路、內(nèi)分泌抵抗通路、轉(zhuǎn)錄因子家族中AP-2 （TFAP2）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、上皮細胞增殖通路、PIP3激活AKT信號通路、雌二醇應激通路等。見圖4。

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法對夏枯草的主要活性成分、作用靶點、相關生物信號通路和乳腺癌等幾方面的關聯(lián)性進行了探討。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和文獻檢索共發(fā)現(xiàn)夏枯草的主要活性成分19個。其中Beta-sitosterol， Kaempferol， Spinasterol， Stigmasterol， Delphinidin， Luteolin， Morin， Vulgaxanthin-I， Poriferasterol monoglucoside_qt， Stigmast-7-enol，Quercetin， Betulinic acid， Ursolic acid， Rosmarinic acid， Hyperoside， Oleanolic acid， Rutin，Hesperidin， Wogonin可能是夏枯草發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)。檢索乳腺癌相關基因，并與夏枯草活性成分作用靶點進行比對，得到29個重復的基因，17種活性較好的化合物，采用Cytoscape軟件計算得到抗乳腺癌的主要成分為Beta-sitosterol， Kaempferol， Luteolin， Morin， Quercetin， Ursolic acid， Wogonin等7種;得到7個關鍵靶點，即CCND1， EGFR， ERBB2， ESR1， MYC， PTEN和TP53。對關鍵靶點進行富集，得到夏枯草抗乳腺癌的關鍵信號通路為乳腺癌通路、內(nèi)分泌抵抗通路、轉(zhuǎn)錄因子家族中AP-2 （TFAP2）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、上皮細胞增殖通路、PIP3激活AKT信號通路、雌二醇應激通路等，推測夏枯草可能通過作用于相關的靶點從而影響相關的信號通路而發(fā)揮藥效。從網(wǎng)絡藥理學角度探討并揭示了夏枯草的主要活性成分、作用靶點、相關生物信號通路和乳腺癌的關系，為進一步研究夏枯草的作用機制提供理論依據(jù)。

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，女性乳腺癌死亡比例占癌癥死亡總數(shù)的11.6%，是僅次于肺癌的第二大癌癥。僅2018年，全球女性乳腺癌新增病例就達210萬，且乳腺癌的發(fā)病率依舊在不斷攀升[26]。在我國，乳腺癌是45歲以下女性腫瘤死亡的最主要原因，且發(fā)病率以每年2%～3%的速度增長[27]。因乳腺癌的病因和發(fā)病機制都很復雜，臨床上針對乳腺癌的治療主要以放化療和手術切除等為主。而中醫(yī)藥治療或輔助治療疾病有其獨特的優(yōu)勢。因此，探索古醫(yī)術中有記載的中藥治療疾病的作用及機制對醫(yī)學的發(fā)展有著非常重要的作用。

課題組前期研究表明，夏枯草的化學成分能抑制乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖[28-30];吳元肇等[31]研究表明夏枯草口服液能誘導雌激素受體陽性的乳腺癌細胞的凋亡;徐華影等[32]研究表明夏枯草活性成分能抑制乳腺癌細胞的遷移。此外，夏枯草制劑或以夏枯草為主的復方制劑在臨床上使用很廣泛且有明顯的療效，如夏枯草片劑和口服液用于治療女性乳腺炎[33]，夏枯草片加逍遙丸可治療乳腺增生和乳腺纖維瘤[34]，但夏枯草抗乳腺癌的作用及機制均無系統(tǒng)的研究報道。

此外，已有文獻報道從茴香中提取的beta-sitosterol能有效抑制乳腺癌MCF-7細胞的轉(zhuǎn)移[35]，且有研究表明beta-sitosterol可作為乳腺癌的雌激素受體α的潛在抑制劑[36];kaempferol能促進乳腺癌細胞的凋亡[37];luteolin能有效抑制乳腺癌細胞的增殖[38];Quercetin納米脂質(zhì)載體能在乳腺癌化學預防中有很好的應用前景[39];Ursolic acid為潛在的抗乳腺癌化合物[40];Wogonin可通過抑制PI3K/Akt/NF- B信號通路而抑制LPS誘導的腫瘤血管新生[41]。

本研究的結(jié)論仍存在一定的局限性，因為本研究僅依托數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)檢索來對藥物的功效進行預測，因此，還需要進行實驗研究來驗證;僅以OB和DL作為活性化合物篩選的指標有一定的局限性，所以在化合物篩選時，也考慮多個中藥數(shù)據(jù)庫和文獻檢索。本研究僅為中藥科研提供一個思路，仍需通過系統(tǒng)的實驗研究進一步證實。

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