劉蓉芳 毛以林 譚雄 張輝 毛湘屏 楊柳 陳志成

〔摘要〕 目的 探討心康沖劑對心衰大鼠Caspase-3、Caspase-9表達的調控作用。方法 58只SD大鼠分為正常組10只，模型組、心康組及對照組各16只，造模完后，心康組給予心康沖劑溶液0.5 g/kg灌服，對照組予芪藶強心膠囊溶液0.06 g/kg灌服。采用心臟彩超檢測心功能;心臟切片行TUNNEL染色法觀察心肌細胞凋亡;心肌組織采用Real-time PCR法及免疫組化法檢測Caspase-3、Caspase-9基因及蛋白質表達。結果 與正常組比，模型組大鼠Caspase-3及Caspase-9的mRNA與蛋白表達顯著增加（P<0.01），TUNNEL染色觀察細胞凋亡明顯增多;與模型組比較，心康組大鼠心肌凋亡減輕， Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA及蛋白明顯下降（P<0.01）;與對照組相比，心康組心肌細胞凋亡相對降低，Caspase-3蛋白表達下降（P<0.05）。結論 心康沖劑可調控下調Caspase-3、Caspase-9表達抗心衰。

〔關鍵詞〕 心肌凋亡;Caspase-3;Caspase-9;慢性心衰;心康沖劑

〔中圖分類號〕R285.5;R541.6 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effects of Xinkang Granule （XKG） on the rats with chronic heart failure （CHF） for the expression of Caspase-3 and Caspase-9. Methods A total of 58 SD rats were randomly divided into a normal group （n=10）， a model group， a XKG group， and a control group， with 16 rats in each group. After the success of the modeling， the XKG group was given XKG solution at 0.5 g/kg， and the control group was given Qili Qiangxin Capsule （QLQXC） solution at 0.06 g/kg. Cardiac function was measured by echocardiography; Heart slices were stained by TUNNEL to observe myocardial apoptosis. The expression of gene and protein of Caspase-3， Caspase-9 were detected by Real-time PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the gene and protein of Caspase-3， Caspase-9 in the model group significantly increased （P<0.01）. TUNNEL observed significant increase of apoptosis. Compared with the model group， the rats in XKG group showed alleviated myocardial apoptosis， and the Caspase-3， Caspase-9 mRNA and protein expression were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the control group， the myocardial apoptosis in the XKG group was relatively decreased， and Caspase-3 decreased （P<0.05）. Conclusion XKG has the function of anti-heart failure by regulating and controlling the expression of Caspase-3 and Caspase-9.

〔Keywords〕 myocardial fibrosis; Caspase-3; Caspase-9; chronic heart failure; Xinkang Granule

多種病理因素（如腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、氧化應激、致炎細胞因子、缺血、壓力或容量負荷過重、缺氧等）均可使慢性心力衰竭（CHF）誘導出現(xiàn)心肌細胞凋亡[1-2]。心肌凋亡是心衰心臟重構（cardiac remodeling， CR）表現(xiàn)形式之一。由半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）家族蛋白介導的心肌凋亡途徑是內源性凋亡途徑，Caspase-3是細胞凋亡的標志[3]，處于凋亡級聯(lián)上游，傳遞信號給下游的Caspase-9從而啟動凋亡程序，Caspase-3/-9是經典凋亡通路中的兩個關鍵蛋白。

ARB、ACEI類藥物是臨床抗心肌重構藥物，由于其相對適應癥、禁忌癥導致藥物使用有一定局限性，因而探討安全有效的抗心肌凋亡中藥顯得尤為迫切。心康沖劑具有健脾滲濕、溫陽化氣逐水飲的功效，前期研究顯示其具有抗慢性心力衰竭[4]，并能改善心肌重構[5-6]。本研究觀察心康沖劑調控慢性心力衰竭大鼠Caspase-3、Caspase-9表達，探討其對慢性心力衰竭大鼠抗心肌凋亡的作用，為治療心衰提供了新的途徑。

1 材料與儀器

1.1 ?實驗動物

58只SPF級SD大鼠，雌雄各半，5周齡，體質量（160±20） g，購于湖南斯克達實驗動物有限公司（實驗動物合格證號：43004700025096）。

1.2 ?藥品及儀器

鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)），末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT，上海江萊生物）;actin（1∶4 000，Mouse，美國proteintech），二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（美國proteintech），HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） （美國proteintech），Caspase-3（1∶1 000，Rabbit，美國CST），Caspase-9（1∶200，Rabbit，美國proteintech），TUNNL試劑盒（武漢博士德生物公司），免疫組化二抗試劑盒 PV-9000（北京中杉金橋生物公司），引物（上海生工合成），心康沖劑（湖南省中醫(yī)院中藥制劑室制備）。動物用彩色多普勒超聲儀（徐州市大為電子設備有限公司），生物信號采集系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國

LEICA），Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團），BX43型雙目生物攝像顯微鏡（日本Olympus）。

2 方法

2.1 ?動物分組及造模

取大鼠10只為正常組，余下大鼠48只按1.5 mg/kg劑量腹腔注射阿霉素，每周2次，共注射7周，以左心室短軸縮短率<30%[7]為心衰造模成功，造模方法參考文獻[8];再按隨機數(shù)字表法分為阿霉素對照組（模型組）16只，心康沖劑1倍等效劑量組16只（心康組），芪藶強心膠囊組（對照組）16只。

2.2 ?藥物制備及干預

心康沖劑溶液配制：白參10 g，薏苡仁30 g，大腹皮10 g，黃芪30 g，桔梗5 g，升麻5 g，柴胡5 g，桂枝10 g，茯苓15 g，生姜皮10 g，陳皮10 g，炒白術10 g，制附片10 g，砂仁6 g。經湖南省中醫(yī)院藥劑科制成干燥顆粒后，按成人等效劑量0.5 g/kg配制成濃度為0.6 g/mL的溶液;對照組給予芪藶強心膠囊溶液，按成人等效劑量（0.06 g/kg），配制為濃度0.073 g/mL。大鼠灌胃劑量按人和動物體表面積折算[9]，正常組、模型組予等體積生理鹽水灌服，每日1次，連續(xù)8周。

2.3 ?指標及檢測方法

2.3.1 ?心臟超聲檢測心功能 ?10%水合氯醛溶液按3 mL/kg麻醉大鼠后前胸脫毛，超聲診斷儀取大鼠左心室長軸切面后進行M超聲檢測，測量左心室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張期內徑（LVIDd）、左室射血分數(shù)（LVEF），所有數(shù)據(jù)均測量3次并取其平均值記錄。

2.3.2 ?TUNNEL染色法檢測細胞凋亡 ?投入10%多聚甲醛溶液固定的大鼠心臟，先后經石蠟包埋、切片、透明、脫水、PBS漂洗后，50 μL TdT+450 μL熒光素標記后反應10 min。再加50 μL TUNEL反應混合液，PBS漂洗、DAPI染色，封片，觀察細胞凋亡情況。

2.3.3 ?Real-time PCR法檢測心肌Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA表達 ?Trizol法提取大鼠心臟組織總RNA，再行RNA的瓊脂糖凝膠電泳。取大鼠左心室心尖部分2 μg，逆轉錄cDNA，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min離心，冰上冷卻，行定量PCR反應。每個樣本每個指標3個孔，每孔10 μL。定量PCR擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達水平。-ΔΔCt=ΔCt對照組-ΔCt樣品，△Ct=△Ct目的-△Ct內參。每個樣本重復3次，然后進行統(tǒng)計分析。

在NCBI上搜索獲得Caspase-3、Caspase-9基因序列，primer5設計引物，上海生工合成。引物序列見表1。

2.3.4 ?免疫組化法檢測心肌Caspase-3、Caspase-9含量 ?心肌標本均經4%多聚甲醛液固定、包埋、切片、脫蠟、乙醇脫水后，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶;微波修復抗原2次，冷至室溫，PBS洗，加1∶100一抗Caspase-3、Caspase-9每片50 μL，4 ℃過夜，加二抗，滴加二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，蘇木精復染、脫水、透明、封片。采用MOTIC圖像分析系統(tǒng)在×400倍光學顯微鏡下對Caspase-3、Caspase-9陽性結果進行半定量分析;分析每個視野下各細胞光密度值，最后取該切片總的平均密度值。

平均光密度值=積分光密度值/所選定視野總面積

2.4 ?統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行處理。全部計量資料用“x±s”表示，先檢驗正態(tài)性，如滿足正態(tài)性，采用單因素方差分析;兩兩比較，方差齊采用方差分析-LSD檢驗，方差不齊用Games-Howell 檢驗;不滿足正態(tài)性時選擇秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 ?各組大鼠心臟超聲結果比較

與正常組比較，模型組心臟擴大而收縮力下降，表現(xiàn)為LVIDd增大，而LVFS、LVEF下降（P<0.01）;與模型組比較，對照組及心康組心腔變小而收縮力增強，LVIDd縮小，LVEF、LVFS升高（P<0.05，P<0.01）;與對照組比較，心康組LVEF升高（P<0.05）。見表2。

3.2 ?TUNNEL法觀察細胞凋亡

400×光鏡下觀察：正常組細胞核排列規(guī)整、呈藍色長梭形。造模后，模型組棕褐色壞死顆粒物質明顯增多;與模型組相比，心康組棕褐色壞死顆粒物質則明顯減少;與對照組相比，心康組心肌細胞凋亡相對較少。見圖1。

3.3 ?Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA比較

模型組與正常組比，Caspase-3、Caspase-9基因表達顯著增加（P<0.01），表明凋亡基因增多;心康沖劑干預后，心康組Caspase-3、Caspase-9基因表達顯著下降（P<0.01）;與對照組比，心康組Caspase-3、Caspase-9基因表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3.4 ?Caspase-3、Caspase-9蛋白表達比較

與正常組比，模型組凋亡蛋白表達增多，Caspase-3、Caspase-9蛋白表達顯著增加（P<0.01）;經心康沖劑、芪藶強心膠囊干預后，心康組及對照組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達顯著下降（P<0.01）;與對照組比，心康組caspase-3表達顯著下降（P<0.05）。見表4、圖2-3。

4 討論

中醫(yī)學將慢性心力衰竭類歸于“水腫”“喘證”“心悸”等范疇。中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭療效肯定，研究證明，芪藶強心膠囊有抗大鼠心肌細胞凋亡作用[10-11]。心康沖劑以真武湯、升陷湯及參苓白術散為基礎方，具有健脾滲濕、溫陽化氣逐水飲功效，能有效治療慢性心衰水腫、喘證、心悸等水濕內停之證[4]。

細胞凋亡發(fā)病機制主要有死亡受體通路、線粒體通路、內質網通路3條途徑。其中由多種生物、理化刺激信號觸發(fā)形成凋亡體，激活Caspase-9，從而剪切并激活下游的Caspase-3導致細胞凋亡，是內源性途徑機制。Caspases介導心肌細胞凋亡并參與慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。Caspase-3是凋亡級聯(lián)反應最關鍵的凋亡蛋白酶[14]。

本實驗中，模型組心肌凋亡明顯增多，LVIDd明顯升高，而LVFS、LVEF顯著下降，同時Caspase-3及Caspase-9的核酸及蛋白表達增加，表明凋亡組織中具有Caspase-3、Caspase-9表達增加的特征。心康沖劑干預后，心肌凋亡減輕，LVIDd明顯下降，

LVEF、LVFS明顯升高，表明心康沖劑具有縮小擴大的心臟、增強心肌收縮力、提升射血功能。與對照組比，心康沖劑組使心臟縮小、心功能提高更明顯，并且下調Caspase-3蛋白表達更明顯，而Caspase-3

mRNA表達無差異，表明心康沖劑調控Caspase-3的mRNA與蛋白表達呈非一致性，說明在調控Caspase-3的mRNA與蛋白表達中有其他因素參與;因此，臨床實踐及動物實驗表明，心康沖劑具有良好的抗心衰竭及抗心肌凋亡作用，臨床值得推廣應用。

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