隋方宇　姜德友　韓潔茹　周雪明　趙銘宇　解穎

摘要 目的：探討NALP6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制。方法：選取慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾NALP6蛋白的基因表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中NALP6蛋白、caspase-1、IL-1β、核因子-κB的表達(dá)情況;結(jié)果：干擾成纖維滑膜細(xì)胞中NALP6基因的表達(dá)，能減低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中NALP6蛋白的表達(dá)、降低caspase-1和核因子-κB的活性，降低IL-1β含量;結(jié)論：NALP6炎性反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程，通過(guò)能夠干擾NALP6基因表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)能保護(hù)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的炎性損傷。

關(guān)鍵詞 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;NALP6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;caspase-1;白細(xì)胞介素-1β;核因子-κB;慢病毒轉(zhuǎn)染;成纖維樣滑膜細(xì)胞;靶點(diǎn)

Study on the Mechanism of NALP6 Signal Transduction Pathway in the Pathogenesis of Gout Arthritis

Sui Fangyu1，Jiang Deyou1，Han Jieru1，Zhou Xueming1，Zhao Mingyu2，Xie Ying1

（1 Basic Medicine Collage，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Department of Gynecology，Heilongjiang Hospital of TCM，Harbin 150036，China）

Abstract Objective：To investigate the action mechanism of the NALP6 signal transduction pathway involved in gout arthritis（GA）.Methods：The lentiviral transfection technology was used to interfere the expression of NALP6 gene and the expression of NALP6，caspase-1，IL-1β and NF-κB was detected by using Elisa，Western Blot and RT-PCR technology.Results：Interfering the expression of the NALP6 genes could reduce the expression levels of NALP6 protein and RNA and NF-κB protein，the activity of caspase-1 and the content of IL-1β in fibroblast-like synoviocytes.Conclusion：1）The study confirmed that the NALP6 signal transduction pathway is involved in the pathogenesis process of GA in rats and revealed that the inflammatory signal of “NALP6-caspase-1-IL-1β” and the cycle pathway of inflammatory cascade between IL-1β and NF-κB play an important role in the process of gouty arthritis.2）The method of interfering the genes expression of NALP6 by lentiviral transfection technology can protect the inflammation injury of fibroblast-like synoviocytes.3）Regarding NALP6 as a target may provide a new idea for clinical prevention and treatment of gouty arthritis.

Key Words Gouty arthritis; NALP6; caspase-1; IL-1β; NF-κB; Lentiviral transfection; Fibroblast-like synoviocytes; Target

中圖分類號(hào)：R229;R593文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.011

NALP6炎性反應(yīng)體可以誘導(dǎo)caspase-1的活化并且能夠參與核因子-κB的調(diào)控，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)的過(guò)程。但是，NALP6是否在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）發(fā)病機(jī)制中起一定的作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們采用大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞制成GA模型，運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾NALP6基因的表達(dá)，通過(guò)觀察NALP6、caspase-1、白細(xì)胞介素（IL）-1β和核因子-κB的表達(dá)情況，探討NALP6炎性信號(hào)通路在GA發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

選取10周齡健康雄性SD大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞（萬(wàn)類生物科技公司提供）。

1.1.2 儀器

慢病毒轉(zhuǎn)染使用儀器和試驗(yàn)。見(jiàn)表1，2。NALP6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制研究?jī)x器和試驗(yàn)。見(jiàn)表3，4。

1.1.3 試劑

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1）慢病毒轉(zhuǎn)染分組：選取空白組、空轉(zhuǎn)染慢病毒載體對(duì)照組、NALP6干擾表達(dá)慢病毒載體組。

2）NALP6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制研究分組：每3孔為一組，共分為4組：a.空白組：正?；ぜ?xì)胞;b.模型組：滑膜細(xì)胞+尿酸鈉;c.模型空轉(zhuǎn)染組：滑膜細(xì)胞+尿酸鈉+空轉(zhuǎn)染慢病毒載體;d.模型NALP6轉(zhuǎn)染組：滑膜細(xì)胞+尿酸鈉+NALP6干擾慢病毒載體。

模型制備：將大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)并留取第三代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，加入MSU溶液制備成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）慢病毒轉(zhuǎn)染：通過(guò)ddCt RQ（Relative Quantitation）以擴(kuò)增公式2-△△Ct對(duì)NALP6的表達(dá)量進(jìn)行分析計(jì)算。

2）NALP6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制研究：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中NALP6蛋白、caspase-1、IL-1β、核因子-κB的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如果數(shù)據(jù)資料滿足正態(tài)性和方差齊性，則應(yīng)用單因素方差分析;如不滿足上述條件則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組慢病毒轉(zhuǎn)染比較

與空白組比較，空轉(zhuǎn)染慢病毒載體空白組NALP6表達(dá)無(wú)明顯變化，NALP6干擾表達(dá)慢病毒載體組的NALP6表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表5。

2.2 NALP6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制

2.2.1 各組滑膜細(xì)胞中IL-1β含量的變化

與空白組比較，模型組細(xì)胞中IL-1β含量明顯升高;與模型組比較，模型NALP6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)IL-1β含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表6。

2.2.2 各組滑膜細(xì)胞中caspase-1活性

與空白組比較，模型組細(xì)胞中caspase-1活性明顯升高;與模型組比較，模型NALP6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)caspase-1活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表7。

2.2.3 各組滑膜細(xì)胞中NALP6蛋白表達(dá)比較

與模型組比較，模型NALP6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)NALP6蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾NALP6基因表達(dá)能夠降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中NALP6蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.2.4 各組滑膜細(xì)胞中核因子-κB蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組細(xì)胞中核因子-κB蛋白表達(dá)明顯升高;與模型組比較，模型NALP6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)核因子-κB蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾NALP6基因表達(dá)能夠降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中核因子-κB蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.2.5 各組滑膜細(xì)胞中IκB蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組細(xì)胞中IκB蛋白表達(dá)明顯降低;與模型組比較，模型NALP6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)IκB蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾NALP6基因表達(dá)能夠升高痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中IκB蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖3。

2.2.6 各組滑膜細(xì)胞中NALP6mRNA表達(dá)情況

與空白組比較，模型組細(xì)胞中NALP6mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，模型NALP6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)NALP6mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)慢病毒感染干擾NALP6基因能夠降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中NALP6mRNA的表達(dá)。見(jiàn)表8。

3 討論

GA是一種自身炎性疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，細(xì)胞外的尿酸濃度過(guò)飽和形成微晶尿酸鈉（MSU）晶體，刺激一系列細(xì)胞因子、趨化因子的釋放，進(jìn)而引起了關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、痛風(fēng)石形成等炎性反應(yīng)[2]。因而MSU晶體是痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的啟動(dòng)因素。雖然MSU晶體在痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制中其作用已經(jīng)闡明，但在滑膜細(xì)胞內(nèi)MSU作為一個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)如何與免疫系統(tǒng)相互作用有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)屬于導(dǎo)師國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目課題中的一部分研究[3-7]，本課題組前期在miR芯片篩選實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了NALP6參與了GA的發(fā)病過(guò)程，但其機(jī)制尚不明確，這也是本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制以IL-1β級(jí)聯(lián)的炎性反應(yīng)為特征[8]。大鼠滑膜細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，MSU刺激的GA滑膜細(xì)胞內(nèi)NALP6表達(dá)上調(diào)，炎性反應(yīng)遞質(zhì)caspase-1活性，IL-1β含量以及核因子-κB表達(dá)均顯著增高，與NALP6表達(dá)正相關(guān)，提示NALP6參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。通過(guò)轉(zhuǎn)染沉默NALP6蛋白表達(dá)的慢病毒感染過(guò)程，能明顯降低caspase-1活性、IL-1β含量以及核因子-κB表達(dá)，提示NALP6可以正調(diào)控炎性反應(yīng)遞質(zhì)caspase-1、IL-1β等。因此推測(cè)NALP6對(duì)caspase-1及核因子-κB有正調(diào)控作用。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的大鼠體外研究表明，尿酸鈉鹽被滑膜表面或胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）識(shí)別，誘導(dǎo)NAPL6形成炎性復(fù)合體[9-10]，從而活化caspase-1，剪切pro-IL-1β，產(chǎn)生成熟的IL-1β，IL-1β活化IL-1R[11-15]，激活核因子-κB。上述一系列反應(yīng)釋放大量細(xì)胞因子、趨化因子等引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)。組織表現(xiàn)為局部充血、水腫、大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維素滲出，同時(shí)沉積部位出現(xiàn)組織凝固性壞死，結(jié)締組織細(xì)胞間質(zhì)纖維變性。我們借助慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)證實(shí)，沉默NALP6表達(dá)能降低NALP6炎性反應(yīng)體激活的能力，影響caspase-1的生成，降低某些炎性反應(yīng)遞質(zhì)（IL-1β和IL-18）產(chǎn)生，從而抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

綜上所述，NALP6蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在GA中起重要作用，對(duì)NALP6的表達(dá)進(jìn)行抑制，可明顯抑制caspase-1的活性和IL-1β的含量，可為臨床防治GA提供新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]汪學(xué)良，劉念，秦天楠，等.痛風(fēng)研究現(xiàn)狀及展望[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2018，7（6）：68-70，80.

[2]周蜜，王一飛，袁佳沁，等.急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2018，39（11）：779-782.

[3]姜德友，李文昊，解穎，等.補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-17表達(dá)水平的影響[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（10）：1574-1577.

[4]姜德友，鄒麗，隋方宇，等.補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清MMP-7影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35（12）：1264-1267.

[5]姜德友，曲曉雪，陳飛，等.補(bǔ)腎利濕法對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠超氧化物歧化酶表達(dá)的影響[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18（1）：11-14.

[6]隋方宇，韓潔茹，周雪明，等.補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎NALP6信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控作用的研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2019，53（2）：81-85.

[7]姜德友，馮濤，陳飛，等.補(bǔ)腎利濕法對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎MMP3、Caspase-5表達(dá)的影響[J].陜西中醫(yī)，2016，37（6）：752-753.

[8]Torres R，Macdonald L，Croll SD，et al.Hyperalgesia，synovitis and multiple biomarkers of inflammation are suppressed by interleukin 1 inhibition in a novel animal model of gouty arthritis[J].Ann Rheum Dis，2009，68（10）：1602-1608.

[9]Grenier JM，Wang L，Manji GA，et al.Functional screening of five PYPAF family members identifies PYPAF5 as a novel regulator of NF-kappaB and caspase-1[J].FEBS Lett，2002，530（1-3）：73-78.

[10]Wang L，Manji GA，Grenier JM，et al.PYPAF7，a novel PYRIN-containing Apaf1-like protein that regulates activation of NF-kappa B and caspase-1-dependent cytokine processing[J].J Biol Chem，2002，277（33）：29874-29880.

[11]Kanneganti TD.Central roles of NLRs and inflammasomes in viral infection[J].Nat Rev Immunol，2010，10（10）：688-698.

[12]Van Gorp H，Kuchmiy A，Van Hauwermeiren F，et al.NOD-like receptors interfacing the immune and reproductive systems[J].FEBS J，2014，281（20）：4568-4582.

[13]Kanneganti TD，Ozren N，Body-Malapel M，et al.Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase-1 through cryopyrin/Nalp3[J].Nature，2006，440（7081）：233-236.

[14]Anand PK，Malireddi RK，Kanneganti TD.Role of the nlrp3 inflammasome in microbial infection[J].Front Microbiol，2011，2：12.

[15]Lupfer C，Thomas PG，Anand PK，et al.Receptor interacting protein kinase 2-mediated mitophagy regulates inflammasome activation during virus infection[J].Nat Immunol，2013，14（5）：480-488.

（2018-07-04收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）