許小琪，楊松林，王軍，賴建輝，郭思旖，王芳，陳求芳，時(shí)軍，3*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州安諾科技股份有限公司， 廣東 廣州 510530； 3.廣東省局部精準(zhǔn)遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)是皮膚深度創(chuàng)傷后創(chuàng)面組織過度修復(fù)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常沉積形成的皮膚纖維化疾病。HS局部表現(xiàn)為皮膚潮紅色，高于正常皮膚組織，質(zhì)堅(jiān)硬并常伴有瘙癢疼痛。除影響患者面貌外觀，HS嚴(yán)重者還會(huì)引起瘢痕附近的器官或關(guān)節(jié)變形，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能障礙，給患者帶來沉重的精神壓力[1]。增生性瘢痕的形成因素多樣，發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確，治療多采用手術(shù)切除，復(fù)發(fā)率較高[2]。

丹酚酸B(Salvianolic acid B,SAB)化學(xué)式為C36H30O16，是活血化瘀中藥丹參中含量最高的水溶性成分，由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成[3]。研究表明，SAB具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[4]，可促進(jìn)缺血心肌血管再生，抑制心、肺、腎纖維化進(jìn)程[5-8]。丹參(或與其他中藥配伍)治療增生性瘢痕多有報(bào)道[9-10]，SAB是否在抑制HS發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，亟待從分子機(jī)制上探明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)等多學(xué)科理論知識(shí)和技術(shù)，從整體角度探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，與中醫(yī)藥辨證施治的整體觀念不謀而合，在系統(tǒng)闡釋藥物多靶點(diǎn)協(xié)同作用、發(fā)現(xiàn)中藥組效關(guān)系和提高藥物研發(fā)效率等方面具有一定作用[11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，構(gòu)建“丹酚酸B-靶點(diǎn)-通路-增生性瘢痕”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步闡明丹酚酸B防治增生性瘢痕的分子作用機(jī)制，以期為丹參治療HS提供候選靶標(biāo)和候選藥物。

1 方法

1.1 SAB相關(guān)靶點(diǎn)的收集與篩選

本實(shí)驗(yàn)中SAB的靶點(diǎn)基于反向藥效團(tuán)匹配法預(yù)測藥物分子靶點(diǎn)、數(shù)據(jù)庫文本挖掘、文獻(xiàn)檢閱。登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)檢索并下載SAB的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)[12]，儲(chǔ)存為mol2格式并上傳至SIB、SEA、ChEMBL活性成分服務(wù)器(https://www.sib.swiss/、http://sea.bkslab.org/、https://www.ebi.ac.uk/chembl/)中進(jìn)行反向分子對(duì)接，下載藥物成分的反向?qū)宇A(yù)測結(jié)果，利用Genecards數(shù)據(jù)庫檢索SAB相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)相關(guān)信息進(jìn)行逐條檢查及篩選，獲得SAB相關(guān)靶點(diǎn)。檢索近10年來SAB抗纖維化疾病的相關(guān)文獻(xiàn)(Pubmed)[13-20]，并進(jìn)行篩選后，補(bǔ)充SAB相關(guān)靶點(diǎn)。將上述所得靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，利用UniProt數(shù)據(jù)庫中Retrieve/ID Mapping功能，選擇物種為“Homo sapiens”，將靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，去重。

1.2 HS相關(guān)靶點(diǎn)的收集與篩選

利用Genecards數(shù)據(jù)庫[21](https://www.genecards.org/)及DisGeNET數(shù)據(jù)庫[22](http://www.disgenet/org)檢索與HS相關(guān)的靶點(diǎn)，以燒傷、外傷和手術(shù)所致皮膚創(chuàng)面增生性瘢痕作為篩選依據(jù)，對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)信息進(jìn)行逐條檢查及篩選，以確保數(shù)據(jù)的可靠性。匯總所得結(jié)果后，利用UniProt將靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，去重。

1.3 SAB治療HS的網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建和分析

利用Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)整理后所得SAB相關(guān)靶點(diǎn)信息、HS相關(guān)靶點(diǎn)信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并運(yùn)用“Network Analysis”中Merge功能對(duì)2個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行映射分析，其中網(wǎng)絡(luò)中交集靶點(diǎn)即為SAB治療HS的潛在靶點(diǎn)，并以節(jié)點(diǎn)(Node)表示藥物分子、疾病及潛在靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間以邊(Edge)相連接，得到“SAB-靶點(diǎn)-HS”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用STRING平臺(tái)[23](https://string-db.org/)構(gòu)建潛在靶點(diǎn)之間的互相作用網(wǎng)絡(luò)(protein protein interactionnetwork,PPI network)，其參數(shù)設(shè)置如下——Organism：Homo sapiens(人類)，minimum required interaction score：medium confidence(0.400)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。下載PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1中，根據(jù)度值(Degree)設(shè)置節(jié)點(diǎn)顏色深淺及形狀大小，根據(jù)靶點(diǎn)相互作用分值(combine score)設(shè)置邊的粗細(xì)，進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.5 GO富集分析

使用Cytoscape 3.6.1中的“ClueGO”插件對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)富集分析[24]，其主要參數(shù)設(shè)置如下—— Organism：Homo sapiens(人類)，勾選GO術(shù)語整合選項(xiàng)以減少冗余富集結(jié)果，Kappa Score默認(rèn)為0.4，pV<0.05，取各簇中最為顯著富集的GO術(shù)語(GO Terms)作為該簇名稱并繪制條形圖。

1.6 KEGG通路富集分析

R是一款擁有豐富工具包的免費(fèi)開源統(tǒng)計(jì)分析軟件，其強(qiáng)大的統(tǒng)計(jì)分析及繪圖功能在數(shù)據(jù)挖掘方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。但注釋文件更新較慢，分析結(jié)果過時(shí)是目前多數(shù)富集分析工具所存在的問題[25]。R語言軟件中clusterProfiler是一款功能強(qiáng)大的工具包，可通過實(shí)時(shí)獲取KEGG最新版本注釋做富集分析，從而得到更具有時(shí)效性的注釋結(jié)果[26]。使用clusterprofiler 3.8對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，設(shè)定基因類型為“Homo sapiens(人類)，閾值為P<0.05，并繪制條形圖，其中節(jié)點(diǎn)顏色表示該信號(hào)通路P.adjust值的大小，節(jié)點(diǎn)長度表示該信號(hào)通路有關(guān)靶點(diǎn)數(shù)量的多少，紅色節(jié)點(diǎn)越長說明該信號(hào)通路的富集顯著性越高。

2 結(jié)果

2.1 潛在靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

收集得到SAB相關(guān)靶點(diǎn)89個(gè)，HS相關(guān)靶點(diǎn)323個(gè)，網(wǎng)絡(luò)映射分析結(jié)果顯示共得到42個(gè)潛在靶點(diǎn)，其“SAB-靶點(diǎn)-HS”網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，左邊粉色節(jié)點(diǎn)為SAB，中間藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為潛在靶點(diǎn)，右邊紫色節(jié)點(diǎn)為HS。

圖1“SAB-靶點(diǎn)-HS”網(wǎng)絡(luò)
Figure1Network of “SAB-Targets-HS”

2.2 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述42個(gè)靶點(diǎn)蛋白信息上傳至STRING平臺(tái)并進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，獲得靶點(diǎn)蛋白之間相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1進(jìn)行可視化處理，以節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，以邊表示各靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，所構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中包含42個(gè)節(jié)點(diǎn)，無孤立節(jié)點(diǎn)，525條相互作用連線，聚類系數(shù)為0.83。PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示，其中節(jié)點(diǎn)顏色越深，節(jié)點(diǎn)越大，表示該靶點(diǎn)的度值越大，反之表示度值越小。邊的線條越粗，表示靶點(diǎn)之間的相互作用分?jǐn)?shù)值越大，反之表示其越小。

2.3 GO分析結(jié)果

GO分析結(jié)果表明，在細(xì)胞組分方面，這些靶點(diǎn)主要為胞膜窖(caveola)、SMAD異源復(fù)合物(heteromeric SMAD protein complex)、常染色質(zhì)(nuclear euchromatin)、核孔復(fù)合體(pore complex)等。分子功能GO分析表明，這些靶點(diǎn)主要富集于TGF-β受體結(jié)合(transforming growth factor beta receptor binding )、金屬肽酶的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of metallopeptidase activity)、趨化因子受體結(jié)合(CCR chemokine receptor binding)、磷脂酶激活劑活性(phospholipase activator activity)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶活性(prostaglandin-endoperoxide synthase activity)等16個(gè)方面。通過分析生物過程結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)涉及60個(gè)生物學(xué)過程中，主要包括:活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)、上皮細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of epithelial cell migration)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(positive regulation of epithelial to mesenchymal transition)、配體缺失的外源性凋亡信號(hào)通路上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的正向調(diào)節(jié)(extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)等(如圖3所示)。

圖2靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)
Figure2PPI network of targets

2.4 KEGG分析結(jié)果

KEGG富集分析得到128條信號(hào)通路，如圖4所示(列舉前20條通路)。其中，如白介素-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、松弛素信號(hào)通路(relaxin signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、Toll樣受體(Toll-like receptor signaling pathway)等通路均與HS密切相關(guān)，體現(xiàn)了SAB多途徑的作用特點(diǎn)。

圖3 靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果Figure 3 Gene ontology analysis of targets

圖4靶點(diǎn)KEGG通路富集結(jié)果(前20條)
Figure4Enrichment of target KEGG pathway (top 20)

3 討論

SAB是活血化瘀中藥丹參的主要水溶性成分之一，顯著抑制心、肺等器官纖維化進(jìn)程，SAB在治療皮膚纖維化疾病方面具有較大的潛力[4]。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，SAB能夠減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠皮膚纖維化程度，抑制人皮膚成纖維細(xì)胞(human skin fibroblast，HSF)增殖，下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和膠原蛋白的表達(dá)，可能與其抑制TGF-β/SMAD和MAPK/ERK信號(hào)通路，且具有抗氧化活性有關(guān)。另外，本課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)[28-29]，穿膜肽TAT修飾載丹酚酸B脂質(zhì)體(SAB-TAT-LIP)在體外能夠顯著抑制HSF的增殖、遷移及侵襲，且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，可能通過將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，誘導(dǎo)HSF凋亡，從而達(dá)到治療HS的效果。通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對(duì)SAB治療HS進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測及分析，對(duì)于進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制具有重要的意義。

本研究通過反向分子對(duì)接預(yù)測、數(shù)據(jù)庫挖掘結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)補(bǔ)充，找到SAB治療HS的潛在作用靶點(diǎn)TGF-β1、MMP2、IL-1β、SMAD3、MAPK8等共42個(gè)，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)均存在相互作用關(guān)系。同時(shí)，通過GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要分布于胞膜窖、SMAD異源復(fù)合物、常染色質(zhì)、核孔復(fù)合體等部位，具有與TGF-β受體結(jié)合、與趨化因子受體結(jié)合、正向調(diào)節(jié)金屬肽酶、調(diào)節(jié)磷脂酶激活劑活性、調(diào)節(jié)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶活性等功能，參與活性氧代謝過程、上皮細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、配體缺失的外源性凋亡信號(hào)通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的正向調(diào)節(jié)等多種生理過程，參與調(diào)控IL-17、TNF、HIF-1/VEGF等信號(hào)通路，表明SAB經(jīng)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抑制HS作用。

上述靶點(diǎn)中，MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP13均為基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族成員，是一類鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶，在損傷修復(fù)、炎癥過程、組織形成、器官重塑等方面均發(fā)揮著重要的作用[30]。皮膚創(chuàng)面膠原(以Ⅰ、Ⅲ膠原為主)合成與降解速度之間的失衡是傷口異常愈合為HS的重要原因之一，而以MMP2、MMP9為主的MMPs是膠原降解的關(guān)鍵成分。有研究認(rèn)為，MMP-9在傷口愈合初期主要由上皮細(xì)胞分泌，能夠刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞的遷移、分化，促進(jìn)上皮再生[31]。MMP2可能通過改變細(xì)胞局部微環(huán)境，促進(jìn)新血管形成和成纖維細(xì)胞增殖、遷移起到重塑皮膚的作用[32]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1和2(TIMP-1,2)是MMPs合成過程的主要調(diào)節(jié)因子，當(dāng)MMPs與TIM-1,2表達(dá)失衡時(shí)，肉芽組織過度增生，膠原結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變等均造成了HS的形成[33]。因此，調(diào)控相關(guān)MMPs的表達(dá)與活性可能是抑制HS的重要手段。預(yù)測結(jié)果提示SAB可能通過作用于多種MMPs靶點(diǎn)發(fā)揮抗HS作用。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β1)在HS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，通過與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合觸發(fā)Smad依賴性或Smad非依賴性途徑的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)炎性因子分泌，上調(diào)纖維化關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，刺激成纖維細(xì)胞分裂增殖，導(dǎo)致膠原蛋白過度合成及ECM沉積[34]。Wang等[35]通過siRNA抑制TGFBR1基因表達(dá)試驗(yàn)，證明TGFBR1-siRNA能夠顯著抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的HSF增殖，降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的mRNA表達(dá)水平，減少I型膠原和纖連蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)量。還有研究發(fā)現(xiàn)SAB在體外能夠抑制TGF-β1、TGFBR1表達(dá)，下調(diào)Smad2/3磷酸化，發(fā)揮抗纖維化疾病的藥理作用，預(yù)測結(jié)果揭示SAB通過作用于TGF-β/Smad通路產(chǎn)生抑制瘢痕增生作用[36]。

Nauta T等[37]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)皮膚受創(chuàng)時(shí)，創(chuàng)面血管損傷，血流受阻，血液供應(yīng)中斷導(dǎo)致局部組織缺氧，影響了組織正常的代謝需求。血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)、TGF-β和腫瘤壞死因子ɑ(TNF-ɑ)等炎性因子和生長因子受到激活后，刺激內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移與增殖，誘導(dǎo)血管增生。當(dāng)創(chuàng)面因長時(shí)間供氧不足形成慢性缺氧時(shí)，易導(dǎo)致傷口愈合不全或愈合時(shí)間緩慢，引起瘢痕增生。研究發(fā)現(xiàn)，SAB可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和ERK的活性從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受炎癥因子的破壞[38]。另外，SAB可能通過下調(diào)JNK的表達(dá)以及阻斷ERK、MAPK磷酸化過程，能夠顯著減少體內(nèi)外PTGS2的表達(dá)，減少前列腺素E2(PGE2)的生成[39]。本預(yù)測結(jié)果提示SAB可能通過調(diào)控HIF-1/VEGF信號(hào)通路，參與創(chuàng)口處微血管生成過程與炎癥反應(yīng)，發(fā)揮防治瘢痕增生的作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)SAB進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測和通路分析，多角度探索丹酚酸B防治增生性瘢痕的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)SAB可能通過抑制成纖維細(xì)胞增殖、抗內(nèi)皮細(xì)胞過度分化、減少炎癥反應(yīng)等機(jī)制發(fā)揮抗瘢痕增生作用，以期為丹參治療增生性瘢痕提供候選靶標(biāo)和候選藥物。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果需要后續(xù)研究中進(jìn)一步的驗(yàn)證和支持。