盧泳，孫冬梅，王洛臨，李智勇，李樹民，李潔環(huán)，馮健英，陳雪婷，徐文杰

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510095； 2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095)

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根[1]，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效[2]。防風(fēng)的成分主要包括色原酮類、香豆素類、有機(jī)酸、多糖類、聚炔類、甾醇類等[3]，其中色原酮作為防風(fēng)的主要活性成分之一，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗感染的作用[4]。2015年版《中國(guó)藥典》一部[防風(fēng)]項(xiàng)下收載了防風(fēng)中2種色原酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法，該方法樣品處理和測(cè)定均耗時(shí)較長(zhǎng)，因此建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的防風(fēng)色原酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定分析方法具有重要意義。近年來(lái)，近紅外光譜(near infrared spectrum,NIRS)分析技術(shù)由于具有樣品一般無(wú)需預(yù)處理、測(cè)量快速無(wú)損、操作簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于制藥、食品、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。本研究以防風(fēng)藥材為研究對(duì)象，用聲光可調(diào)濾光器(AOTF)便攜式近紅外儀采集其近紅外光譜，建立其2種色原酮(升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷)的定量分析模型，為防風(fēng)藥材中色原酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的快速檢驗(yàn)提供一種新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-8恒溫水浴鍋(邦西儀器科技上海有限公司)；METTLER TOLEDO XS205 DualRange型電子分析天平(德國(guó)梅特勒-托利多有限公司)；YR-150多功能粉碎機(jī)(永康市五瑞工貿(mào)有限公司)；Agilent Technologies 1200 series型高效液相色譜儀(G1322A脫氣機(jī)，G1312A二元梯度泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314B VWD檢測(cè)器)；AOTF Luminary 3060型聲光可調(diào)濾光器近紅外光譜儀，配有積分球漫反射附件、銦鎵砷(InGaAs)檢測(cè)器、CaF2分束器、樣品旋轉(zhuǎn)器、石英樣品杯(美國(guó)Brimrose公司)。

1.2 試藥

93批防風(fēng)藥材分別購(gòu)自外蒙古、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、甘肅、山西、河南、河北、湖南、湖北等產(chǎn)地，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院李智勇博士鑒定均為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根。

升麻素苷對(duì)照品(批號(hào)：111522-201511)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品(批號(hào)：111523-201509)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(賽默飛世爾中國(guó)有限公司，色譜純)、水(廣州屈臣氏食品飲料公司)、甲醇(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定防風(fēng)中2種色原酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[5]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：甲醇-水(40∶60)，流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；理論塔板數(shù)按升麻素苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷對(duì)照品和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，加入甲醇，制成每1 mL含升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷分別為127.2、128.0 μg的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取防風(fēng)藥材細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 樣品測(cè)定 精密稱取樣品0.25 g，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 μL，注入色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。93份樣品中升麻素苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.066 4%～0.656 0%；5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.117 5%～0.749 7%。

2.2 近紅外光譜定量模型的優(yōu)化和建立

2.2.1 近紅外光譜的采集 將收集到的93批防風(fēng)樣品粉碎后過(guò)80目篩，取約8 g藥粉放入石英樣品杯中，平鋪均勻，以空氣為參比，采用積分漫反射部件進(jìn)行掃描，儀器參數(shù)：波長(zhǎng)范圍1 100～2 300 nm；光程2 nm；掃面次數(shù)100次；溫度25 ℃；相對(duì)濕度40%。每批樣品重復(fù)裝填并掃面3次，求平均圖譜。93批樣品近紅外圖譜疊加圖見圖1。

0.80.70.60.50.40.31100130015001700190021002300λ/nmAbsorbance

圖193批防風(fēng)藥材近紅外光譜疊加圖

Figure1NIR spectrum overlay of 93 batches Radix Sanoshnikovia

由圖1可知，1 100～2 300 nm波段區(qū)間內(nèi)光譜比較平滑，不同樣品間的近紅外光譜吸收無(wú)明顯差異，但1 300～2 200 nm區(qū)間近紅外光譜信息量較豐富，能反映出樣品中的色原酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異，因此在此區(qū)間內(nèi)進(jìn)行建模研究。

2.2.2 近紅外光譜定量模型的建立

2.2.2.1 模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定

本研究采用校正相關(guān)系數(shù)(Rc)、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(Rp)、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSEC)、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSEP)作為指標(biāo)篩選，其中Rc和Rp越接近1，表示預(yù)測(cè)值與測(cè)定值越接近[6]。RMSEC和RMSEP越小，兩者差異越小，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)效果越好，適用性就越好。

2.2.2.2 樣本集的劃分

根據(jù)樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果，利用隨機(jī)(random selection，RS)法[7]選取83個(gè)具有代表性的樣品組成校正集，其余10個(gè)樣品為驗(yàn)證集，二者比例為8∶1，各樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍見表1。驗(yàn)證集樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在校正集樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，可用于近紅外光譜定量模型的建立。

2.2.2.3 建模方法的選擇

在近紅外光譜分析中常用的多元定量校正方法，是建立分析儀器響應(yīng)值與物質(zhì)質(zhì)量濃度之間定量數(shù)學(xué)關(guān)系的一類算法。在近紅外光譜儀分析中常用的定量建模方法包括多元線性回歸(MLR)法、主成分回歸(PCR)法和偏最小二乘(PLS)法等線性校正方法。其中，PLS在近紅外光譜分析中得到較為廣泛的運(yùn)用，成為了一種常用的建模方法。因此，本研究選擇PLS建模，以期得到較為穩(wěn)定、預(yù)測(cè)能力較好的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的定量模型。

2.2.2.4 不同光譜預(yù)處理方法的選擇

藥材樣品由于顆粒大小和光散射等噪聲信息及測(cè)定條件等差異，導(dǎo)致基線漂移影響近紅外光譜定量模型的可靠性和準(zhǔn)確性，需對(duì)原始光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以減少各種干擾的影響，提高分析準(zhǔn)確度。用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，其常見的光譜預(yù)處理方法有多元散射校正(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)、求導(dǎo)(一階導(dǎo)數(shù)1st Derivative、二階導(dǎo)數(shù)2nd Derivative)、平滑處理(S-G卷曲平滑、Norris平滑)[8-10]等。以模型評(píng)價(jià)指標(biāo)Rc、Rp、RMSEC、RMSEP，通過(guò)對(duì)預(yù)處理方法的對(duì)比優(yōu)選出S-G卷曲平滑作為升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型光譜預(yù)處理方法。結(jié)果見表2。

2.2.2.5 不同光譜區(qū)段的選擇

由于全波段光譜中除包含待測(cè)組分信息，還包含大量冗余信息，為獲取與待測(cè)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)的最大信息、減少冗余信息，以建立最優(yōu)的預(yù)測(cè)模型[11]，對(duì)不同光譜范圍所建模型性能進(jìn)行考察，結(jié)果見表3。通過(guò)與其他波段的對(duì)比，確定1 300～1 900 nm為升麻素苷定量模型最佳建模區(qū)間、優(yōu)選出1 300～2 200 nm為5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型最佳建模區(qū)間。

2.2.2.6 主成分的選擇

主成分對(duì)模型的建立具有很大的影響，過(guò)少或過(guò)多均會(huì)影響模型的準(zhǔn)確性[12]。本研究以RMSEC為指標(biāo)，RMSEC越小，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度越高。以影響模型的主成分值為橫坐標(biāo)，RMSEC為縱坐標(biāo)作圖，得圖2。結(jié)果表明升麻素苷定量模型的最佳主成分值為16，此時(shí)RMSEC為0.028；5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型的最佳主成分值為19，此時(shí)RMSEC為0.011 9。

2.2.2.7 定量模型的建立

分別將83批升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷校正集樣品，通過(guò)The Unscramler7.8化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件結(jié)合PLS法，按表4所示升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的最優(yōu)建模參數(shù)，建立定量分析模型。結(jié)果見圖3。

表1 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷定量模型校正集和驗(yàn)證集的劃分Table 1 Partition of calibration and validation set in prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methyl-vismitol

表2 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)NIR模型的影響Table 2 Influence of different pretreatment on NIR model

表3 不同波長(zhǎng)范圍對(duì)NIR模型的影響Table 3 Influence of different wavelength range on NIR models

由圖3可知升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷Rc分別為0.975 8、0.992 3，Rp分別為0.904 0、0.907 3；RMSEC分別為0.028、0.011 9；RMSEP為0.055 6、0.041 3。說(shuō)明模型可以用于色原酮成分的定量分析，且預(yù)測(cè)誤差較小，NIRS預(yù)測(cè)值與HPLC實(shí)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型準(zhǔn)確度和預(yù)測(cè)結(jié)果良好?？梢圆捎媒t外光譜法對(duì)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行快速無(wú)損的測(cè)定。

2.2.2.8 定量模型的驗(yàn)證

分別在建立的定量分析模型中，將升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷驗(yàn)證集樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較并計(jì)算平均相對(duì)誤差，詳見表5。結(jié)果表明，NIRS所建模型的對(duì)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果與HPLC法的測(cè)定結(jié)果接近，平均相對(duì)誤差均小于10%，表明所建模型具有良好的預(yù)測(cè)能力，可用于防風(fēng)藥材中2種色原酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。

3 討論

本研究采用NIRS法建立了防風(fēng)藥材中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷2種色原酮成分的快速檢測(cè)方法，建立的定量模型預(yù)測(cè)精度較高，預(yù)測(cè)集的平均相對(duì)誤差均<10%。相較傳統(tǒng)的HPLC方法，不需要繁瑣的供試品制備，不消耗化學(xué)試劑，不產(chǎn)生任何污染[13]。

近紅外光譜技術(shù)作為一種分析速度快、效率高的在線分析技術(shù)，一般檢測(cè)限為0.1%，不適用于痕量分析[14]。雖然在本研究中部分樣本集升麻素苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.1%，但運(yùn)用這些樣本所建立的定量模型相關(guān)系數(shù)仍都大于0.9，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度、精密度較好。說(shuō)明近紅外光譜技術(shù)對(duì)于某些質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.1%的化學(xué)成分同樣適用。

0.120.110.100.090.080.070.060.05RMSEC135791113151719主成分值135791113151719主成分值0.100.090.080.070.060.050.04BA

A.升麻素苷； B. 5-O-甲基維斯阿米醇苷。

AB0.10.20.30.40.50.60.70.80.10.20.30.40.50.60.70.80.70.60.50.40.30.20.100.80.70.60.50.40.30.20.10實(shí)測(cè)值/%預(yù)測(cè)值/%實(shí)測(cè)值/%

A.升麻素苷； B.5-O-甲基維斯阿米醇苷。

圖3防風(fēng)中2種色原酮成分的定量校正模型
Figure3Quantitative calibration models of two chromones in Radix Saposhnikoviae

表5 驗(yàn)證集樣品中2種色原酮成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HPLC與NIRS測(cè)定結(jié)果

Table5HPLC measured and NIRS predicted mass fraction results of two chromones in validation setw/%

編號(hào)升麻素苷HPLC法NIRS法平均相對(duì)誤差編號(hào)5-O-甲基維斯阿米醇苷HPLC法NIRS法平均相對(duì)誤差FF040.331 20.355 06.138 2FF140.213 30.185 18.509 3FF100.334 30.356 0FF190.201 10.203 0FF140.246 80.217 7FF230.155 50.171 6FF210.118 40.134 2FF400.208 50.215 8FF280.270 90.216 0FF620.313 20.337 2FF370.248 50.296 0FF670.367 20.331 7FF410.270 50.211 0FF740.354 90.350 4FF820.259 50.207 0FF790.237 70.293 0FF880.324 60.325 0FF840.296 2 0.331 9FF910.136 10.147 0FF870.371 80.360 3

本研究共收集不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防風(fēng)藥材共93批，得到的定量校正模型預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)均在0.9以上；但未高于0.95，預(yù)測(cè)結(jié)果還存在一定的誤差。這可能是因?yàn)榉里L(fēng)產(chǎn)地分布廣、含量豐富，所采用的樣本集不具有較好的代表性導(dǎo)致的。此外，還可能是因?yàn)楸狙芯恐猩煞衷陂L(zhǎng)波近紅外光譜范圍的基線漂移、噪音影響較大，結(jié)構(gòu)信息不夠豐富而導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)有一定的誤差。在后期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)擴(kuò)大樣本范圍，采用近紅外光譜全波長(zhǎng)進(jìn)行建模，結(jié)合更多更優(yōu)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提高2種色原酮模型的預(yù)測(cè)能力。