梁澤宇，余秋恩，尹佳隆，孫圣偉，何健，李坤平

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.湯臣倍健股份有限公司，廣東 廣州 511436)

蜂膠(Propolis)是蜜蜂科昆蟲意大利蜂ApismelliferaL.工蜂采集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物[1]。現(xiàn)代研究證明蜂膠具有抑菌、抗氧化、抗感染、降脂、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等功效[2-5]，其黃酮類成分和酚酸類成分被認(rèn)為是其主要的活性物質(zhì)[5-7]。國(guó)產(chǎn)蜂膠產(chǎn)量有限而市場(chǎng)需求較大，巴西蜂膠因其特殊的產(chǎn)地來(lái)源而具有特殊的生理活性[8-9]，是國(guó)內(nèi)蜂膠市場(chǎng)的有益補(bǔ)充[10]。然而，國(guó)內(nèi)對(duì)巴西蜂膠與國(guó)產(chǎn)蜂膠化學(xué)成分及生物活性的對(duì)比研究鮮有報(bào)道[11-12]，相關(guān)研究工作有待開展。本試驗(yàn)以14份巴西蜂膠和12份國(guó)產(chǎn)蜂膠為研究對(duì)象，對(duì)其總黃酮、總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及DPPH自由基清除能力進(jìn)行了比較，以期為其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

UV2550型紫外-可見光分光光度儀(日本島津公司)；MFJ-W300粉碎機(jī)(北京利仁科技有限公司)、DL-360A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

沒(méi)食子酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%，批號(hào)A0110)和蘆丁對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%，批號(hào)A0103H)為成都曼斯特科技公司產(chǎn)品。1,1-2-苯基-2-苦基肼(DPPH)和Folin-Ciocalteu試劑均為Sigma公司產(chǎn)品；95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)乙醇、甲醇、Na2CO3均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。14批巴西蜂膠和12批國(guó)產(chǎn)蜂膠供試樣品由湯臣倍健股份有限公司提供，見圖1。

圖114批巴西蜂膠(A)與12批國(guó)產(chǎn)蜂膠(B)供試品

Figure1Fourteen batches of Brazilian propolis samples (A) and twelve batches of Chinese propolis samples (B)

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精確稱取蘆丁對(duì)照品18.0 mg、沒(méi)食子酸對(duì)照品11.0 mg，分別置于25 mL 和10 mL容量瓶中，以95%乙醇溶解，即得0.72 mg/mL蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液、1.1 mg/mL沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，適當(dāng)稀釋后可用作對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取26批蜂膠樣品，每批約20 g，置于-20 ℃冷凍后粉碎，準(zhǔn)確稱取粉碎后樣品各0.100 g，加入3 mL 95%乙醇超聲提取60 min，靜置，取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.3 樣品乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參照GB/T 24283—2018[13]，采用減重法對(duì) 26 批蜂膠樣品進(jìn)行了乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果如表1所示。采用GraphPad Prism 6軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作對(duì)比箱式圖，以Student’st-tests進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(下同)。見圖2。

表1 26批蜂膠乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

Table1The content of ethanol extract in 26 batches of propolis samples (n=3) %

序號(hào)巴西蜂膠xRSD序號(hào)國(guó)產(chǎn)蜂膠xRSD156.281.021539.561.28257.382.051672.411.55356.811.531756.511.34450.541.121836.672.08553.451.631938.420.75645.611.422058.581.13755.770.252133.941.13849.461.482218.623.76953.201.662332.991.151052.431.652445.281.271155.251.802558.141.221245.521.022632.772.061338.651.571449.600.67

國(guó)產(chǎn)蜂膠巴西蜂膠806040200w(乙醇提取物)/%**

**P<0.01。

圖214批巴西蜂膠與12批國(guó)產(chǎn)蜂膠乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較箱式圖

Figure2Box plot of ethanol extract content in tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples

由表1、圖2可知，2組供試樣品乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著性差異(P<0.01)。 其中，巴西蜂膠乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.42%±3.61%；國(guó)產(chǎn)蜂膠乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.68%±14.60%，其乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)組內(nèi)差異較大。

2.4 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.4.1 直接比色法測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13-14]，分別精密吸取0.072 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，95%乙醇定容至25 mL，測(cè)定波長(zhǎng)360 nm，以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)擬合得相應(yīng)的回歸方程為A=51.278ρ-0.006 9(r=0.999)，在2.88～14.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密量取各供試品溶液50 μL，定容至25 mL，于360 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每份樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見表2。

2.4.2 Al3+螯合比色法測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13-14]，分別精密吸取0.072 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加入 95%乙醇6 mL后，加入Al(NO3)3溶液(100 mg/mL) 0.5 mL和醋酸鉀溶液(98 mg/mL) 0.5 mL，加95%乙醇定容至25 mL，搖勻，暗處?kù)o置1 h，測(cè)定波長(zhǎng)415 nm，以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)擬合得回歸方程為A=24.34ρ+0.001 1(r=0.997)，在2.88～14.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密量取各批次蜂膠供試品溶液50 μL，同上操作后于415 nm處測(cè)定吸光度，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3、圖3。

由表2、3可知，以直接比色法測(cè)定的巴西蜂膠和國(guó)產(chǎn)蜂膠供試樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.91%±1.68%和10.01%±3.85%；以Al3+螯合比色法測(cè)定的巴西蜂膠和國(guó)產(chǎn)蜂膠供試樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.17%±2.25%和13.51%±6.26%。從圖3可看出，采用2種不同方法測(cè)定的2組供試蜂膠總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且Al3+螯合比色法測(cè)定值均高于直接比色法。

表2 直接比色法測(cè)定蜂膠中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果

Table2The content of total flavonoids analyzed by direct colorimetric method (n=3 ) %

序號(hào)巴西蜂膠xRSD序號(hào)國(guó)產(chǎn)蜂膠xRSD17.431.2158.722.3027.721.621616.304.0237.502.931714.080.5844.313.13188.182.9355.492.69198.840.7966.651.412014.161.9376.231.11215.982.2186.731.16223.003.6894.175.53237.480.42107.014.942410.940.96118.030.942514.020.76122.511.59268.321.79132.613.64145.482.31

表3 Al3+螯合比色法測(cè)定蜂膠中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果

Table3The content of total flavonoids analyzed by Al3+chelating colorimetric method(n=3) %

序號(hào)巴西蜂膠xRSD序號(hào)國(guó)產(chǎn)蜂膠xRSD19.380.161513.641.5828.470.931624.883.0639.041.101721.271.0745.351.74188.621.9956.972.12199.513.7567.505.092021.761.5178.441.28218.941.7588.072.82223.405.4795.223.62238.487.51108.891.882413.323.351110.332.622513.532.48122.945.432611.732.81133.143.04146.595.43

********2015105030201001510503020100國(guó)產(chǎn)蜂膠巴西蜂膠國(guó)產(chǎn)蜂膠巴西蜂膠w(總黃酮)/%w(總黃酮)/%w(總黃酮)/%w(總黃酮)/%ⅠⅡAB直接比色法Al3+螯合法直接比色法Al3+螯合法

Ⅰ.直接比色法測(cè)定；Ⅱ.Al3+螯合比色法測(cè)定；A.巴西蜂膠；B.國(guó)產(chǎn)蜂膠。**P<0.01。

圖32種方法測(cè)定蜂膠中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果的比較箱式圖

Figure3Box plots of total flavonoids content in tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples by two different methods

2.5 總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]，分別精密吸取0.11 mg/mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，置于5 mL容量瓶?jī)?nèi)，各加入純水3 mL，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑0.25 mL，搖勻，靜置5 min，再加入 20% Na2CO3溶液0.75 mL，純水定容，混勻，室溫靜置30 min后于763 nm波長(zhǎng)下測(cè)定，以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=109.27ρ-0.008 4(r=0.999)，結(jié)果在3.3～7.7 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

分別精密吸取26批蜂膠供試品溶液100 μL，加1 900 μL純水配成稀釋液。吸取100 μL稀釋液，按上述方法操作后，于763 nm下測(cè)定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果見表4、圖4。

表4和圖4的結(jié)果表明：巴西蜂膠中總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于國(guó)產(chǎn)蜂膠，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但是，國(guó)產(chǎn)蜂膠不同批次樣品間總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，最高達(dá)到了28.99%，最低僅為5.87%。

2.6 自由基清除活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16-17]，分別精密吸取適當(dāng)稀釋后的供試品溶液10、25、50、100、200 μL于試管中，并以95%乙醇補(bǔ)至200 μL，再加入DPPH溶液(0.025 mg/mL)3 mL，搖勻；室溫靜置25 min后，于516 nm測(cè)定吸光度Ai，并計(jì)算清除率E=(A0-Ai)/A0×100%(A0為空白對(duì)照溶液的吸光度)；以樣品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，清除率(E)為縱坐標(biāo)作回歸曲線，計(jì)算EC50(清除率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度)，結(jié)果見表5、圖5。

表5、圖5結(jié)果表明，巴西蜂膠和國(guó)產(chǎn)蜂膠供試樣品清除DPPH活性的EC50分別為(47.28±21.51) μg/mL和(34.61±21.14) μg/mL ，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)蜂膠清除自由基能力稍強(qiáng)一些，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 26批蜂膠中總酚酸測(cè)定結(jié)果

Table4The content of total phenolic acids in 26 batches of propolis samples (n=3) %

序號(hào)巴西蜂膠xRSD序號(hào)國(guó)產(chǎn)蜂膠xRSD113.831.611514.593.21212.392.401628.992.71313.480.661723.952.1748.791.031813.742.47510.423.521914.902.76611.682.832025.324.20713.381.222110.633.27814.151.08225.871.7199.743.882313.200.421013.553.032418.173.111114.680.732519.050.84126.084.252614.051.77135.710.751411.280.75

國(guó)產(chǎn)蜂膠巴西蜂膠**403020100w(總酚酸)/%

**P<0.01。

圖4巴西蜂膠與國(guó)產(chǎn)蜂膠總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較箱式圖

Figure4Box plot of total phenolic acids content in tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples

表5 26批蜂膠中DPPH自由基清除活性測(cè)定結(jié)果

Table5DPPH free radical scavenging activity of 26 batches of tested propolis samples

序號(hào)巴西蜂膠EC50/(μg·mL-1)回歸系數(shù)序號(hào)國(guó)產(chǎn)蜂膠EC50/(μg·mL-1)回歸系數(shù)132.800.998 81536.690.999 6254.750.999 91623.580.998 6332.790.999 21733.000.999 9456.690.998 61828.790.999 9540.240.999 61926.300.999 6637.340.999 62022.840.999 9738.340.998 52154.250.999 2835.430.999 92288.190.999 9959.170.999 92319.640.999 21031.240.999 72416.470.999 21127.230.998 62513.650.997 21290.950.998 62651.880.999 91393.360.998 61431.520.999 9

國(guó)產(chǎn)蜂膠巴西蜂膠**100806040200DPPH自由基清除活性EC50/(μg?mL-1)

**P<0.01。

圖5巴西蜂膠與國(guó)產(chǎn)蜂膠DPPH自由基清除活性的對(duì)比箱式圖

Figure5Box plot of free radical scavenging capacity of tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples

3 討論

研究表明，蜂膠的化學(xué)物質(zhì)組成與其產(chǎn)地來(lái)源有較大關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，巴西蜂膠的乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于國(guó)產(chǎn)蜂膠，且前者的組內(nèi)差異也較小；而國(guó)產(chǎn)蜂膠乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到72.41%，最低僅為18.62%，差異懸殊，提示不同批次樣品品質(zhì)的一致性較差，相應(yīng)的蜂膠質(zhì)量管理需規(guī)范。

在諸多文獻(xiàn)報(bào)道中，黃酮和酚酸類成分被認(rèn)為是蜂膠主要的活性物質(zhì)[5-7]，蜂膠總黃酮和總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其質(zhì)量密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種比色法檢測(cè)所得巴西蜂膠和國(guó)產(chǎn)蜂膠總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相比較而言，國(guó)產(chǎn)蜂膠的總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高，但國(guó)產(chǎn)蜂膠不同批次樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異亦較大，這可能與我國(guó)幅員遼闊，蜂膠的產(chǎn)地、膠源植物和毛膠采收方式各有不同等有關(guān)。

黃酮和酚酸類成分的自由基清除活性已被大量的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)，蜂膠因含有此類成分而成為天然的自由基清除劑[9,16-17]。本研究中的2組蜂膠樣品，盡管其總黃酮、總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，且巴西蜂膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍低，但其DPPH自由基清除活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與龔蜜等[16]和Teixeira等[17]的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明巴西蜂膠可能含有其他類活性成分，對(duì)自由基有較好的清除能力。

綜上所述，基于26份供試蜂膠樣品，發(fā)現(xiàn)巴西蜂膠的乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于國(guó)產(chǎn)蜂膠，而國(guó)產(chǎn)蜂膠的總黃酮和總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于巴西蜂膠，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但值得一提的是，巴西蜂膠和國(guó)產(chǎn)蜂膠的清除自由基活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是否說(shuō)明巴西蜂膠醇提物中還有其他活性成分，具體有待進(jìn)一步研究。