王凡 陳迪 焦婷 楊會琴

先天性白內(nèi)障是兒童時期常見的致盲性眼科疾病，其中8%～25%患者與遺傳有關(guān)[1]，多數(shù)表現(xiàn)為單基因遺傳病，其遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、性連鎖相關(guān)遺傳，其中常染色體顯性遺傳是其最常見的遺傳方式[2]。單基因遺傳性白內(nèi)障既可單獨(dú)發(fā)病，也可伴隨其他眼部發(fā)育異常，如小角膜、無虹膜、視網(wǎng)膜病變等[3]。先天性白內(nèi)障晶狀體混濁類型分為核性、繞核性、前極性、后極性、粉塵狀、縫狀、珊瑚狀、全白內(nèi)障等[4]。目前已報道與先天性白內(nèi)障有關(guān)的致病基因有40多種，主要是調(diào)控晶狀體蛋白合成的晶狀體蛋白基因和膜蛋白基因(GJA1、GJA3、GJA8、MIP、MP19)，部分為調(diào)節(jié)眼球發(fā)育的基因，還有少量其他基因，如熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子4等[5]。在先天性白內(nèi)障的致病基因中，晶狀體蛋白基因突變約占1/2，縫隙連接蛋白基因突變約占1/4[3]。本研究擬分析一個常染色體顯性遺傳的先天性白內(nèi)障家系，確定其致病基因，分析其基因型與表型相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集中國一個先天性白內(nèi)障家系，該家系共有四代14人，其中白內(nèi)障患者5例，正常親屬9人。本研究遵循赫爾辛基宣言并經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，全部參與者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 家系病歷采集詳細(xì)詢問家族史、繪制家系圖譜(圖1)，并進(jìn)行全面的眼科檢查，包括普通視力及最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡、直接檢影鏡眼底檢查。

1.2.2 DNA提取抽取該家系所有成員外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-4 ℃保存。采用康為世紀(jì)CW0544試劑盒進(jìn)行DNA分離、提取，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 一先天性白內(nèi)障家系圖譜。圓形代表女性，方形代表男性，空心表示正常，實(shí)心表示患者，箭頭表示先證者，斜線表示已去世

1.2.3 致病基因檢測采用二代測序方法進(jìn)行基因分析，程序如下：用酶切法將DNA樣本進(jìn)行片段化，末端修復(fù)，3’末端加“A”，再加接頭得到350～400 bp的片段，進(jìn)行PCR富集，最后利用生物分析儀(安捷倫科技有限公司安捷倫2100)進(jìn)行文庫構(gòu)建分析，設(shè)計(jì)60 bp標(biāo)記生物素的探針結(jié)合目標(biāo)區(qū)域基因的外顯子，采用液相捕獲試劑盒(北京邁基諾基因科技股份有限公司)將目標(biāo)基因捕獲后用新一代測序儀(Illumina公司illuminaNextSeq 500)進(jìn)行二代測序，并進(jìn)行生物信息分析。對發(fā)現(xiàn)的變異進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。

1.2.4 致病性分析家系共分離分析：對收集的其他家系成員進(jìn)行突變位點(diǎn)的Sanger測序，確定其基因型。保守性比對：比較此位點(diǎn)所編碼的氨基酸在不同位點(diǎn)間氨基酸序列的保守性。功能預(yù)測軟件分析：運(yùn)用在線分析軟件PolyPhen-2和SIFT幫助判斷其致病性。檢索正常人群數(shù)據(jù)庫(北京邁基諾基因科技股份有限公司)，判斷該變異是否存在于正常人群。

2 結(jié)果

2.1 家系資料及遺傳學(xué)特征該家系共四代14人，其中5例患有先天性白內(nèi)障，表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，患者男女比例為23，均無其他眼部疾病及全身性疾病。先證者IV2為一名3歲男孩，自幼視物不清伴眼球震顫，雙眼視力均為0.025，雙眼水平震顫、頻率快，無明顯休止眼位，同時注視時角膜映光點(diǎn)為+30°～+35°，固視不良，雙眼晶狀體呈全白色混濁。術(shù)前眼底模糊，眼B超檢查未見眼后段異常，術(shù)后雙眼散瞳查眼底無明顯異常。其母親III3晶狀體混濁類型為雙眼點(diǎn)狀晶狀體混濁(圖2),右眼視力0.04,左眼視力0.03，眼位正；眼B超檢查未見眼后段異常，術(shù)后眼底檢查未見異常。其他3例患者均為雙眼患者且已行白內(nèi)障摘出術(shù)，白內(nèi)障形態(tài)未知，眼底未見異常改變。

圖2 家系中患者眼前段照相。A:先證者：晶狀體全白色混濁；B：先證者母親：點(diǎn)狀晶狀體混濁

2.2 突變結(jié)果分析基因檢測發(fā)現(xiàn)，該家系先證者及其他白內(nèi)障患者的GJA8基因的第二外顯子存在雜合錯義突變(c.199G>T)(圖3)，該突變導(dǎo)致GJA8基因編碼的Cx50蛋白第67位氨基酸D被Y代替(p.Asp67Tyr)，該突變在正常親屬中均未發(fā)現(xiàn)。在不同物種該突變所在位點(diǎn)的氨基酸具有高度保守性。信息分析工具PolyPhen-2和SIFT均提示其為白內(nèi)障致病性變異。

圖3 該家系GJA8基因測序圖。上圖為正常對照；下圖為GJA8 c.199G>T 的錯義突變

3 討論

晶狀體的透明性主要靠晶狀體內(nèi)相對穩(wěn)定的離子、水分、pH值以及晶狀體蛋白的有序排列。晶狀體自身無血管，其營養(yǎng)物質(zhì)獲得、新陳代謝以及物質(zhì)循環(huán)依賴晶狀體縫隙連接蛋白[3]。縫隙連接蛋白在晶狀體細(xì)胞間通訊中起著重要作用，對晶狀體細(xì)胞的存活、功能和維持晶狀體的均質(zhì)性和透明性尤其重要[6]。晶狀體中的縫隙連接蛋白有三種：Cx43、Cx46以及Cx50，分別由GJA1、GJA3和GJA8編碼[7]。GJA8基因位于1q21.1,含1612 bp、2個外顯子區(qū)域，編碼由433個氨基酸組成的連接蛋白Cx50，在晶狀體纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中高表達(dá)，并參與晶狀體組織的生長和分化[8]。Cx50是一種膜蛋白，包括四個跨膜區(qū)(M1、M2、M3和M4)、兩個胞外結(jié)構(gòu)域(E1、E2)和三個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(1個細(xì)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)及細(xì)胞質(zhì)C端和N端)[9]。相鄰六個細(xì)胞外環(huán)作用形成連接子，相鄰兩個連接子互相連接，形成細(xì)胞間縫隙連接通道。細(xì)胞間縫隙連接通道參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸，對細(xì)胞的生長、分化、凋亡和腫瘤的形成等有重要的調(diào)節(jié)作用[10]。此外，這些蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，特別是GJA8(CX50)，還參與細(xì)胞周期阻滯[11]。這些蛋白的突變造成原發(fā)性或繼發(fā)性晶狀體纖維形成，導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。通過不同物種間的多序列比對、分析，縫隙連接蛋白胞外環(huán)是縫隙連接通道中重要且高度保守的結(jié)構(gòu)域，Cx50E1環(huán)在連接蛋白對接中作用重大，環(huán)內(nèi)氨基酸的突變導(dǎo)致細(xì)胞間偶聯(lián)丟失，形成功能缺失突變[12-16]。有文獻(xiàn)報道，Cx50基因突變時小鼠無法形成正常間隙通道導(dǎo)致白內(nèi)障及小眼球發(fā)生[17-18]。

目前已確定與先天性白內(nèi)障有關(guān)的GJA8突變有40種，其中錯義突變38種，移碼突變2種；絕大部分表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳(36種)，僅2種表現(xiàn)為隱性遺傳。導(dǎo)致的先天性白內(nèi)障類型中核性最多見，也可表現(xiàn)為粉塵狀、全白、縫狀等，伴或不伴隨先天性小角膜，未見明確的基因型與表型相關(guān)性[16,19-23]。

本研究中，該家系所有白內(nèi)障患者均在GJA8基因的第二外顯子中發(fā)現(xiàn)了雜合的錯義突變(c.199G>T)，而在正常親屬及正常人群數(shù)據(jù)庫中均未發(fā)現(xiàn)相同改變。保守性比對、致病性預(yù)測軟件分析均提示其有致病性，可以明確此突變是導(dǎo)致該家系發(fā)生先天性白內(nèi)障的原因，導(dǎo)致細(xì)胞外區(qū)域發(fā)生改變影響到細(xì)胞間的耦合和縫隙連接形成，進(jìn)一步影響晶狀體正常代謝，這可能是該家系先天性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。