王智 邵威 袁學(xué)雙 彭輝燦 費(fèi)志剛 肖啟國 夏世剛

弱視是兒童視力低下的常見原因。目前，視神經(jīng)可塑性的研究是當(dāng)前弱視發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路是一類在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路，廣泛存在于無脊椎和脊椎動(dòng)物中。β-鏈蛋白(β-catenin)是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，因此，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路也稱為Wnt/β-catenin信號(hào)通路。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的主要調(diào)控酶。近年來研究顯示，Wnt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)發(fā)生，神經(jīng)元分化、遷移，突觸發(fā)生以及軸突生長具有重要的調(diào)控作用[1-2]。但是在視覺發(fā)育期內(nèi)，關(guān)于Wnt信號(hào)通路與視覺發(fā)育可塑性及弱視形成之間的關(guān)系目前研究尚少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察Wnt信號(hào)通路蛋白β-catenin和GSK-3β在單眼形覺剝奪性弱視(monocular deprivation amblyopia，MD)大鼠視皮層的表達(dá)變化，闡明Wnt信號(hào)通路在視覺發(fā)育可塑性和弱視形成過程中的作用，為弱視的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器蘇木素、枸櫞酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、免疫組織化學(xué)SP超敏試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗大鼠β-catenin和GSK-3β多克隆抗體(武漢貝茵萊生物科技有限公司)。眼電生理視覺誘發(fā)電位儀(法國Metrovision公司)，組織石蠟脫水機(jī)(德國，Leica ASP200S)，組織石蠟包埋機(jī)(德國，Leica EG1160)，顯微鏡(廈門麥克奧迪公司Motic，BA210T)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理生后14 d的健康SD大鼠64只(購于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)，隨機(jī)分為MD組和正常 (normal postnatal，NP) 組，每組32只。MD組均行左眼瞼緣縫合術(shù)，根據(jù)剝奪時(shí)間又分為單眼剝奪7 d、21 d、45 d、90 d 4個(gè)小組，每小組8只；NP組不作任何處理，相應(yīng)分為7 d、21 d、45 d、90 d 4個(gè)小組，每小組8只。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均在同等條件下飼養(yǎng)，室溫下自由飲食和飲水，每日光照時(shí)間約 12 h。每天早、晚檢查縫合眼有無眼瞼開裂。在生后21 d(單眼剝奪7 d)，兩組大鼠均行閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，F(xiàn)-VEP)檢查，記錄P波振幅和潛伏期。

1.3 標(biāo)本獲取與制作單眼剝奪7 d、21 d、45 d、90 d，兩組各隨機(jī)選取8只大鼠處死。具體步驟：稱體質(zhì)量后用10 g·L-1水合氯醛溶液150 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射麻醉，大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，迅速打開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室—主動(dòng)脈穿刺，在右心耳剪一出口，快速注入4 ℃的生理鹽水200 mL，接著快速灌注4 ℃含多聚甲醛的PBS液(pH 7.2～7.4)30 min，后緩慢灌注2 h，灌注結(jié)束后處死大鼠，開顱取腦，依據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》分別切取MD組和NP組大鼠右側(cè)視皮層的腦組織，于含多聚甲醛的PBS溶液中固定24～48 h。按常規(guī)步驟脫水、浸蠟、包埋，而后進(jìn)行4 μm厚度切片，常溫下保存。

1.4 免疫組織化學(xué)染色切片常規(guī)脫蠟至水后浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，微波爐加熱至沸騰后斷電進(jìn)行熱修復(fù)抗原，加入含體積分?jǐn)?shù)3%H2O2的滅活內(nèi)源性酶，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗大鼠β-catenin、GSK-3β多克隆抗體(1200)一抗，4 ℃過夜，37 ℃ 復(fù)溫，滴加兔抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；酒精脫水。取出后置于二甲苯中10 min×2次，中性樹膠封片、顯微鏡下觀察。

1.5 計(jì)算機(jī)圖像分析每只大鼠隨機(jī)選取兩張切片，顯微攝像系統(tǒng)采集圖像，從外至內(nèi)依次隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400倍)，經(jīng)Image Plus Pro 6.0軟件測(cè)量采集的圖片。測(cè)得每個(gè)視野中的GSK-3β和β-catenin蛋白的平均光密度(A)值，算出平均值，作為蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠F-VEP檢查結(jié)果F-VEP檢查結(jié)果示，與NP組大鼠相比，MD組大鼠P波潛伏期明顯延長，振幅明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05；見表1)。說明MD組弱視模型建立成功。

表1 MD組和NP組大鼠F-VEP檢查結(jié)果

組別nP波潛伏期/msP波振幅/μVNP組3279.68±8.7423.59±3.65MD組32125.64±15.657.56±2.61t值15.23-21.16P值0.000.00

2.2 GSK-3β在大鼠視皮層的表達(dá)GSK-3β免疫陽性神經(jīng)元呈黃色或棕黃色染色。顯微鏡下可見，NP組7 d、21 d大鼠視皮層有少量GSK-3β的表達(dá)，主要集中在視皮層神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中；在45 d、90 d，GSK-3β的表達(dá)有所增加，但組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。MD組單眼剝奪7 d大鼠視皮層即可見明顯的GSK-3β的表達(dá)，隨剝奪時(shí)間的延長，GSK-3β表達(dá)明顯增加，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與NP組相比，MD組單眼剝奪后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠視皮層GSK-3β的表達(dá)均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見圖1和表2。

2.3 β-catenin在大鼠視皮層的表達(dá)NP組7 d大鼠視皮層可見明顯的β-catenin的表達(dá)，在21 d、45 d時(shí)β-catenin的表達(dá)有所下降，在90 d時(shí)β-catenin表達(dá)趨于穩(wěn)定，其中45 d與90 d時(shí)β-catenin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較β-catenin表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。MD組單眼剝奪7 d大鼠視皮層即可見明顯的β-catenin表達(dá)，剝奪21 d、45 d、90 d時(shí)β-catenin表達(dá)明顯降低，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與NP組相比，MD組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠視皮層β-catenin的表達(dá)均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表3和圖2。

圖1 MD組和NP組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠視皮層GSK-3β的表達(dá)(×400)。A、B、C、D分別為NP組7 d、21 d、45 d、90 d；A1、B1、C1、D1分別為MD組單眼剝奪7d、21 d、45 d、90 d

組別GSK-3β蛋白表達(dá)剝奪7 d剝奪21 d剝奪45 d剝奪90 dNP組2.10±0.112.15±0.362.19±0.312.22±0.41MD組2.31±0.312.89±0.283.55±0.193.85±0.45t值33.2017.7329.4766.46P值<0.05<0.05<0.05<0.05

組別β-catenin表達(dá)剝奪7 d剝奪21 d剝奪45 d剝奪90 dNP組3.56±0.263.42±0.123.25±0.063.20±0.10MD組2.49±0.132.23±0.051.88±0.101.64±0.10t值-15.57-43.52-22.99-22.32P值<0.05<0.05<0.05<0.05

圖2 MD組和NP組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠視皮層β-catenin的表達(dá)(×400)。A、B、C、D分別為NP組7 d、21 d、45 d、90 d；A1、B1、C1、D1分別為MD組單眼剝奪7 d、21 d、45 d、90 d

3 討論

弱視是兒童常見的眼病，單眼形覺剝奪是導(dǎo)致弱視的主要原因之一。弱視的實(shí)質(zhì)是視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)異常視覺經(jīng)驗(yàn)(如單眼形覺剝奪)引起視覺神經(jīng)環(huán)路變化，其基本機(jī)制是活動(dòng)依賴的突觸可塑性變化[3]。在視覺發(fā)育可塑性關(guān)鍵期內(nèi)及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療弱視，能取得良好的效果，但對(duì)于大齡兒童和成年弱視，目前尚缺乏有效的治療方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在視覺發(fā)育可塑性關(guān)鍵期后，成年的視皮層仍具有可塑性。因此，重啟視覺發(fā)育敏感期進(jìn)而有效改善青少年及成人患者的治療效果成為研究的熱點(diǎn)。視皮質(zhì)不斷發(fā)育、塑形的過程既包括神經(jīng)元形態(tài)的變化，又包括神經(jīng)元周圍細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境成分的改變，二者共同構(gòu)成了視皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)可塑性[4]。有研究表明，視皮質(zhì)神經(jīng)元的長時(shí)程增強(qiáng)與視皮質(zhì)可塑性密切相關(guān)[5]，單眼剝奪3 d足以改變小鼠初級(jí)視皮層V1B區(qū)Ⅱ/Ⅲ層興奮性錐體神經(jīng)元視皮層活動(dòng)依賴的突觸可塑性[3]。

Wnt信號(hào)通路是一類在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路。近來研究顯示，Wnt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)發(fā)生，神經(jīng)元分化、遷移，突觸發(fā)生以及軸突生長具有重要的調(diào)控作用[1-2]。激活未成熟的海馬神經(jīng)元中的Wnt通路，表現(xiàn)出樹突分支的長度和數(shù)目的增加；抑制Wnt信號(hào)通路能夠阻斷海馬神經(jīng)元的長時(shí)程增強(qiáng)[6]。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，β-catenin作為關(guān)鍵效應(yīng)分子，起正向調(diào)節(jié)作用，而GSK-3β作為負(fù)向調(diào)節(jié)因子，是重要的激酶，位于β-catenin的上游。GSK-3β是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的主要調(diào)控酶，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分，參與細(xì)胞的分化、增殖、黏附和凋亡[7]，以及受體轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸可塑性，在建立和維持神經(jīng)元極性中起重要作用[8]。GSK-3β的活化能抑制長時(shí)程增強(qiáng)[9]，使位于生長錐的腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2的Thr-514和Ser-518磷酸化，降低腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2與管蛋白和Numb的相互作用，抑制軸突對(duì)特異性黏附分子的胞飲作用和軸突生長錐內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制軸突生長[10-11]。而應(yīng)用GSK-3β抑制劑(如LiCl、SB216763、SB415286或發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA等)抑制GSK-3β活性后可以促使神經(jīng)元多軸突形成[12-13]。

有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠慢性高眼壓模型中GSK-3β活性的變化參與了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目減少和視神經(jīng)的變性[14]，但關(guān)于Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白GSK-3β和β-catenin與視覺發(fā)育可塑性及弱視形成之間關(guān)系的相關(guān)研究尚少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立MD大鼠模型，觀察Wnt信號(hào)通路蛋白β-catenin和GSK-3β在MD大鼠視皮層的表達(dá)變化。在Wnt信號(hào)通路中GSK-3β位于β-catenin的上游，正常情況下，GSK-3β能負(fù)性調(diào)節(jié)β-catenin，使之失活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NP組大鼠相比，MD組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大腦視皮層中GSK-3β的表達(dá)明顯增多，而β-catenin的表達(dá)逐漸降低，可能與GSK-3β的表達(dá)增多導(dǎo)致β-catenin失活相關(guān)。因此，我們推測(cè)Wnt信號(hào)通路可能通過GSK-3β和β-catenin表達(dá)的變化參與視覺發(fā)育可塑性的調(diào)控和弱視的形成，但上游信號(hào)通過何種途徑調(diào)控GSK-3β和β-catenin的表達(dá)以及其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。