宮玉波 許永杰 仇長(zhǎng)宇 趙軍 王媛 郭小華 高薇 司少艷 秦亞亞 吳斌 羅靈 趙宏偉

隨著航天技術(shù)的進(jìn)步及國(guó)際空間站活動(dòng)的開展，越來越多的航天人員需要進(jìn)行長(zhǎng)期太空工作。長(zhǎng)期處于太空失重環(huán)境下可以導(dǎo)致視盤水腫、視網(wǎng)膜棉絮斑、神經(jīng)纖維層增厚等眼部損害[1-2]。眼部損害會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致視功能下降，而良好的視功能對(duì)于航天工作人員成功安全地完成空間飛行任務(wù)至關(guān)重要。關(guān)于失重對(duì)眼部影響的研究較多，失重引起眼部病變與時(shí)間密切相關(guān)，這些眼部病變主要與失重狀態(tài)下的血液頭向分布、顱內(nèi)壓增高及靜脈淤血有關(guān)[3-4]。靜脈淤血表示眼部血流動(dòng)力學(xué)異常，目前關(guān)于失重對(duì)眼部血流研究較少，主要是短期研究[5-6]；而對(duì)于長(zhǎng)期失重狀態(tài)下眼底血流變化尚未見報(bào)道。為此，本研究通過尾吊大鼠模擬長(zhǎng)期微重力環(huán)境，研究其對(duì)大鼠眼部血流及眼軸的影響。還有研究表明[7-8]，失重狀態(tài)亦影響機(jī)體細(xì)胞免疫功能，太空飛行中Th細(xì)胞亞群中Th1/Th2發(fā)生漂移，γ-干擾素 (interferon-γ，IFN-γ)白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的細(xì)胞比值降低，即Th2漂移；Th2漂移在空間飛行中持續(xù)存在，則有可能發(fā)生自身免疫性疾病、超敏反應(yīng)以及與細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能下降相關(guān)的疾病。因此，本研究中我們通過連續(xù)檢測(cè)失重大鼠血清中IFN-γ(Th1因子)及IL-10(Th2因子)表達(dá)，分析其變化規(guī)律，探討失重狀態(tài)下機(jī)體的免疫狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量為220～260 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002]。本實(shí)驗(yàn)方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的使用和處理符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。IFN-γ、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(哈靈生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組取40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法均分為8組：正常對(duì)照組、尾吊1 d組、尾吊4 d組、尾吊1周組、尾吊2周組、尾吊1個(gè)月組、尾吊2個(gè)月組、尾吊3個(gè)月組，每組5只大鼠。

1.2.2 模擬微重力環(huán)境大鼠失重模型建立采用尾懸吊法建立大鼠失重模型[9]。所有大鼠單籠飼養(yǎng)，尾部懸吊，使后肢懸空，保持頭低位，并使身體縱軸與水平線呈-30°夾角，前肢著地可自由活動(dòng)，所有大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2.3 大鼠眼軸長(zhǎng)度及視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)以大鼠右眼作為實(shí)驗(yàn)眼，按3 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠。檢測(cè)前大鼠眼滴表面麻醉劑2次。采用Acuson Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行檢測(cè)，探頭型號(hào)：15L8-S，頻率10 MHz，彩色多普勒增益固定在50 dB，圖像深度調(diào)至2.0 cm。

1.2.3.1 各組大鼠眼軸長(zhǎng)度測(cè)量探頭涂適量耦合劑后置于大鼠右眼角膜，以固定物為持探頭的手腕部支點(diǎn)，避免探頭壓迫眼球。軸位掃描，探頭標(biāo)志朝上，二維顯示大鼠眼球輪廓，輕微調(diào)整探頭方向，使視神經(jīng)暗區(qū)在眼球后壁清晰顯示，測(cè)量各組大鼠眼軸長(zhǎng)度，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

1.2.3.2 各組大鼠視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)二維顯示眼球輪廓，輕微調(diào)整探頭方向，使視神經(jīng)暗區(qū)在眼球后壁清晰顯示，啟動(dòng)彩色多普勒超聲診斷儀。以紅、藍(lán)色伴行且垂直于眼球壁或交替出現(xiàn)進(jìn)入眼球后壁的彩色血流信號(hào)作為大鼠視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈(central retinal artery，CRA)和視網(wǎng)膜中央靜脈(central retinal vein，CRV)。利用轉(zhuǎn)向角功能，使脈沖多普勒角度盡量<30°。將取樣容積調(diào)整為1 mm，置于彩色CRA血流最亮處。選擇清晰的5個(gè)心動(dòng)周期圖像，測(cè)定收縮期最大血流速度(peak systolic velocity，PSV)、舒張末期血流速度(end diastolic velocity，EDV)。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。所有操作均由同一名醫(yī)師完成。

1.2.4 大鼠血清中IFN-γ、IL-10含量測(cè)定各組大鼠分別于相應(yīng)時(shí)間取材，每組各取3只，心臟采血1.5 mL。室溫下靜置20 min，待自然凝固后3000 r·min-1離心5 min，取血清-80 ℃儲(chǔ)存。按ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組大鼠血清中IFN-γ、IL-10含量。

2 結(jié)果

2.1 CRA的血流動(dòng)力學(xué)各參數(shù)變化CRA的PSV比較見表1，結(jié)果顯示：正常對(duì)照組與尾吊1 d、4 d、1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，尾吊各組PSV均較正常對(duì)照組下降；尾吊1 d組除與尾吊1個(gè)月組、2個(gè)月組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)外，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；尾吊2周組除與尾吊1周組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，PSV降至較低；尾吊1個(gè)月組同尾吊2周組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同尾吊2個(gè)月組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PSV較2周時(shí)部分恢復(fù)，但仍低于正常對(duì)照組；尾吊3個(gè)月組同其余各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，PSV降至最低。

CRA的EDV比較見表1：正常對(duì)照組除與尾吊1 d組、尾吊1周組及尾吊2個(gè)月組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(均為P>0.05)，與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，尾吊各組EDV均較正常對(duì)照組下降；尾吊2周組與尾吊1周組、尾吊1個(gè)月組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，與尾吊2個(gè)月組、尾吊3個(gè)月組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，EDV降至較低；尾吊1個(gè)月組與尾吊2個(gè)月組、尾吊3個(gè)月組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；尾吊2個(gè)月組除與尾吊1 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，與其他尾吊組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，EDV逐漸恢復(fù)；尾吊3個(gè)月組與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，EDV降至最低。

組別nPSV/cm·s-1EDV/cm·s-1正常對(duì)照組50.133±0.0060.083±0.006尾吊1 d組50.107±0.0140.063±0.005尾吊4 d組50.093±0.0100.060±0.009尾吊1周組50.083±0.0100.057±0.005尾吊2周組50.080±0.0080.053±0.005尾吊1個(gè)月組50.097±0.0130.057±0.010尾吊2個(gè)月組50.103±0.0130.070±0.008尾吊3個(gè)月組50.063±0.0130.037±0.005

2.2 眼軸長(zhǎng)度變化比較正常大鼠眼軸長(zhǎng)(0.542±0.023)cm，尾吊1 d后眼軸長(zhǎng)(0.512±0.003)cm，尾吊4 d后眼軸長(zhǎng)(0.502±0.003)cm，尾吊1周后眼軸長(zhǎng)(0.497±0.006)cm，尾吊2周后眼軸長(zhǎng)(0.500±0.003)cm，尾吊1個(gè)月后眼軸長(zhǎng)(0.488±0.008)cm，尾吊2個(gè)月后眼軸長(zhǎng)(0.506±0.006)cm，尾吊3個(gè)月后眼軸長(zhǎng)(0.506±0.003)cm；尾吊1 d組除與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，其余各組均較尾吊1 d組眼軸變短；尾吊1個(gè)月同尾吊各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，眼軸最短；尾吊3個(gè)月組同尾吊2個(gè)月組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 血清中IFN-γ、IL-10含量比較根據(jù)IFN-γ、IL-10標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其吸光度值，以吸光度值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程，IFN-γ：Y=1228.2X-53.138(R2=0.999)，IL-10：Y=39.241X-0.811(R2=0.997)。

各組大鼠血清中IFN-γ、IL-10含量比較見表2。正常對(duì)照組與尾吊1 d、4 d、1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月組血清中INF-γ含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，尾吊各組IFN-γ表達(dá)均較正常對(duì)照組增加；尾吊1 d組除與尾吊1個(gè)月組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，IFN-γ含量升至最高；尾吊2周組與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，IFN-γ含量降至最低，但仍高于正常對(duì)照組；尾吊1個(gè)月組除與尾吊1 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，IFN-γ含量又逐漸升高；尾吊3個(gè)月組同其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，IFN-γ含量基本穩(wěn)定。

正常對(duì)照組與尾吊1 d、4 d、1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月組血清中IL-10含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，尾吊各組IL-10含量均較正常對(duì)照組降低，尾吊1 d組下降明顯；尾吊2周組與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，IL-10含量升高，但仍低于正常對(duì)照組；尾吊1個(gè)月組與其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，IL-10含量又下降；尾吊2個(gè)月組同尾吊1個(gè)月組、尾吊3個(gè)月組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，尾吊2個(gè)月、3個(gè)月IL-10含量逐漸增加。

組別nIFN-γ/pg·mL-1IL-10/pg·mL-1正常對(duì)照組3713.000±9.16562.453±0.341尾吊1 d組31288.000±30.76447.870±2.636尾吊4 d組31173.000±17.19748.460±1.881尾吊1周組31050.333±18.41650.683±1.595尾吊2周組3899.000±12.76254.283±0.781尾吊1個(gè)月組31257.333±15.54542.443±1.946尾吊2個(gè)月組31183.667±10.46150.820±1.232尾吊3個(gè)月組31116.000±23.75251.927±0.736

3 討論

失重狀態(tài)下人體血液向上半身轉(zhuǎn)移，體液重新分配影響頭頸部血流；關(guān)于失重狀態(tài)下頭頸部血流變化的研究較多，但仍存在異議。有研究表明[10]，-6°頭低位臥床模擬失重21 d 過程中，雙側(cè)椎動(dòng)脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈血流參數(shù)總體上維持穩(wěn)態(tài)，模擬失重未對(duì)椎動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈血流產(chǎn)生明顯影響。但也有研究表明，失重/模擬失重狀態(tài)下腦血流變化不定，有研究顯示腦血流降低[11]，有研究則顯示腦血流增加[12]。而失重/模擬失重狀態(tài)下對(duì)眼底血流變化研究較少，長(zhǎng)期失重狀態(tài)下眼底血流變化更是未見報(bào)道。為此，我們建立失重大鼠模型，連續(xù)觀察3個(gè)月模擬長(zhǎng)期微重力環(huán)境對(duì)大鼠CRA血流動(dòng)力學(xué)的影響及眼軸長(zhǎng)度的變化，探討其變化規(guī)律。本研究中CRA的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)主要包括PSV、EDV；PSV反映了血管充盈和血流供應(yīng)強(qiáng)度，EDV反映了遠(yuǎn)側(cè)組織的血流灌注狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，尾吊1 d，大鼠PSV較正常對(duì)照組下降，隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，PSV逐漸降低，至尾吊2周時(shí)，PSV降至低值；此后PSV部分恢復(fù)，至尾吊3個(gè)月，PSV下降至最低。本研究結(jié)果顯示，隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，EDV逐漸下降，尾吊2周至1個(gè)月降至較低值；至尾吊3個(gè)月后降至最低。本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期模擬微重力環(huán)境對(duì)大鼠眼底血流有明顯影響；隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，眼底血流降低，期間眼底血流部分恢復(fù)；眼底血流變化呈負(fù)向曲線分布。本研究表明，失重狀態(tài)下眼底血流總體是降低的，同有關(guān)研究相符[13]。但也有研究表明，太空飛行狀態(tài)下，航天人員眼底血流速度較飛行前是增快的[14]。太空飛行狀態(tài)下，顱內(nèi)壓增加，為保持眼部血流供應(yīng)，CRA流速則需要按比例增加。但事實(shí)表明，長(zhǎng)期失重狀態(tài)下眼部出現(xiàn)視盤水腫、視網(wǎng)膜棉絮斑、神經(jīng)纖維層增厚等病變可能與CRA流速不足以適應(yīng)顱內(nèi)壓致眼部低灌注所致。因此，增加眼部血供對(duì)航天員眼部健康至關(guān)重要。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，失重狀態(tài)亦影響眼軸長(zhǎng)度變化。隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，眼軸漸漸變短，至尾吊1個(gè)月時(shí)，眼軸最短。本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期模擬微重力環(huán)境對(duì)大鼠眼軸長(zhǎng)度影響顯著；隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，眼軸變短；眼軸變化呈負(fù)向曲線分布，變化較平緩。眼軸長(zhǎng)度的變化亦導(dǎo)致了屈光狀態(tài)的改變。

目前研究顯示，航天飛行環(huán)境會(huì)影響機(jī)體的免疫功能，但其具體機(jī)制仍未完全闡明[15]。有研究指出，進(jìn)行長(zhǎng)期太空飛行的宇航員，因機(jī)體細(xì)胞免疫功能降低，導(dǎo)致體內(nèi)潛伏病毒激活，增加病毒感染風(fēng)險(xiǎn)[16]。為此，本研究分別以IFN-γ、IL-10作為Th1因子、Th2因子代表，通過建立失重大鼠模型，初步探討長(zhǎng)期失重狀態(tài)下大鼠血清中IFN-γ(Th1因子)及IL-10(Th2因子)表達(dá)及變化規(guī)律。Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)與細(xì)胞毒性和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥的形成；Th2細(xì)胞的主要功能為刺激B細(xì)胞增生并產(chǎn)生抗體，與體液免疫相關(guān)。在一定條件下，Th2型細(xì)胞因子對(duì)Th1型細(xì)胞因子的發(fā)育與功能起拮抗作用；反之，Th1型細(xì)胞因子亦可抑制Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)。Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞功能的平衡和消長(zhǎng)是免疫調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)，當(dāng)這個(gè)平衡失調(diào)并向Th1或Th2轉(zhuǎn)化時(shí)，稱為Th1/Th2的偏移。

本研究結(jié)果顯示，尾吊大鼠血清中IFN-γ含量明顯增加。尾吊1 d后，大鼠IFN-γ含量明顯增加達(dá)最高，此后緩慢下降，至尾吊2周降至最低，但仍高于正常對(duì)照組，至尾吊3個(gè)月后仍保持較高水平；大鼠IFN-γ含量變化呈“M形”正向曲線分布。而尾吊大鼠IL-10含量明顯降低，尾吊1 d后，大鼠IL-10含量明顯降低，至尾吊3個(gè)月后逐漸增加，仍低于正常對(duì)照；大鼠IL-10含量變化呈“W形”負(fù)向曲線分布。

綜上所述，長(zhǎng)期模擬微重力環(huán)境對(duì)大鼠眼底血流及眼軸長(zhǎng)度均有影響；隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，眼底血流流速降低，眼軸長(zhǎng)度變短；而尾吊早期大鼠血清中IFN-γ高表達(dá)，而IL-10表達(dá)下降；隨尾吊時(shí)間延長(zhǎng)，IFN-γ雖下降，但仍高于正常水平，而IL-10表達(dá)雖升高，但仍低于正常水平。血清中IFN-γ與IL-10表達(dá)相互制約，IFN-γ高表達(dá)，IL-10低表達(dá)，反之亦然，二者保持動(dòng)態(tài)平衡。