魏達(dá)亨 孫麗麗 何慧君 柯宗文 劉華

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)作為黃斑的退行性疾病，是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人致盲最主要的原因，且患病率逐年增加[1-2]。AMD根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理改變的不同分為滲出型(濕性)和萎縮型(干性)。濕性AMD主要特點(diǎn)是脈絡(luò)膜新血管形成，目前通常使用抗新生血管藥物治療，而干性AMD主要與Bruch膜和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞之間的病理沉積玻璃膜疣有關(guān)，目前尚無(wú)確切有效的治療方法。干性AMD的早期發(fā)病機(jī)制包括炎癥、氧化應(yīng)激等各種因素所致的RPE細(xì)胞正常生理功能受損，而RPE細(xì)胞持續(xù)異常最終會(huì)導(dǎo)致患者視力下降，甚至失明[3]。

木犀草素作為一種天然黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化等特性[4-5]。目前已有報(bào)道表明黃酮類(lèi)化合物在體內(nèi)和體外對(duì)RPE細(xì)胞均具有保護(hù)作用[6-8]，作為黃酮類(lèi)化合物之一的木犀草素也對(duì)心臟、肝臟和神經(jīng)等有抗炎作用[9-10]。但目前木犀草素對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)作用尚缺乏充足證據(jù)。因此，本研究旨在探討木犀草素對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞及視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為治療干性AMD提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人RPE細(xì)胞(ARPE-19)，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，置于體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡C57/BL6J雄性小鼠30只，體質(zhì)量(23±2)g，購(gòu)自北京維通利華有限公司。自由進(jìn)食和飲水，室溫18～23 ℃、濕度50%～65%，12 h/12 h晝夜交替光照環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器木犀草素(南京景竹生物科技有限公司)；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS(美國(guó)Hyclone公司)；hoechst 33342凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；Annexin V-FITC/PI Kit凋亡檢測(cè)試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；cleaved caspase-3、HMGB1、NF-κB一抗、兔二抗(美國(guó)CST公司)；碘酸鈉(北京索萊寶公司)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司)；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥公司)。光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；超高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠成像儀(美國(guó) GE公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；小動(dòng)物眼底成像系統(tǒng)(美國(guó)Phoenix公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn)分組首先將ARPE-19細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、碘酸鈉模型組(碘酸鈉，1 g·L-1)、木犀草素濃度梯度治療組(10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)，采用MTT法測(cè)定木犀草素有效濃度范圍；確定木犀草素最佳有效濃度后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、碘酸鈉模型組、木犀草素治療組(50 μmol·L-1)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組與模型建立小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組、碘酸鈉模型組、木犀草素治療組，每組10只。木犀草素治療組使用木犀草素(腹腔注射，50 mg·kg-1·d-1)預(yù)處理1周，對(duì)照組、碘酸鈉模型組給予等體積生理鹽水；隨后碘酸鈉模型組和木犀草素治療組經(jīng)鼠尾靜脈注射碘酸鈉(25 mg·kg-1)建立干性AMD模型，對(duì)照組給予等體積生理鹽水；造模后木犀草素治療組繼續(xù)使用木犀草素(腹腔注射，50 mg·kg-1·d-1)處理，對(duì)照組、碘酸鈉模型組給予等體積生理鹽水。4周后各組均進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 MTT測(cè)評(píng)木犀草素的有效濃度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板。每組5個(gè)復(fù)孔，于37 ℃孵育24 h，加入20 μL MTT(5 g·L-1)孵育4 h，去上清液并加入150 μL DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)吸光度(A)值。

1.2.4 Hoechst 33342染色檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞凋亡將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ARPE-19細(xì)胞接種于6孔板。分組處理24 h后棄上清液，PBS緩沖液洗3次，每孔加入1 mL Hoechst染料(10 μmol·L-1)均勻覆蓋于細(xì)胞表面，37 ℃孵育15 min，PBS緩沖液洗細(xì)胞3次，用350 nm激發(fā)波長(zhǎng)、460 nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞凋亡率用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞至離心管，1000 r·min-1離心5 min，棄去上層清液，PBS緩沖液重懸洗滌，離心棄去上層清液，加入1×Binding buffer重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC混勻后室溫避光孵育5 min，加入10 μL 20 mg·L-1磺化丙啶(propidium Iodide,PI)，并加400 μL PBS緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞中HMGB1、NF-κB和cleaved caspase-3的蛋白相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞分組處理24 h后胰蛋白酶消化并收集至離心管，4000 r·min-1離心5 min，加入含10 g·L-1PMSF的RIPA裂解液冰上裂解，4 ℃ 25 000 r·min-1離心25 min后取上清液，二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)法測(cè)定蛋白濃度，制樣備用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，10 g·L-1BSA封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影。Image J測(cè)量各組基因灰度值并分析。

1.2.7 OCT觀察小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)和厚度變化10 g·L-1戊巴比妥鈉溶液(腹腔注射，80 mg·kg-1)麻醉小鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，角膜使用眼用凝膠后調(diào)整OCT鏡頭和參數(shù)進(jìn)行觀察并拍照，圖像均以1個(gè)視盤(pán)間隔為標(biāo)準(zhǔn)采集，InSight軟件測(cè)量視網(wǎng)膜厚度。

1.2.8 HE染色取小鼠眼球蠟塊包埋，以視神經(jīng)與角膜中心為軸向切片備用。眼球切片梯度脫蠟至水，蘇木素染色5 min，流水沖洗，鹽酸乙醇分化 30 s，流水沖洗15 min，伊紅染色2 min，梯度脫水，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。

第一類(lèi)“根據(jù)材料回答”類(lèi)，我一般會(huì)告訴學(xué)生答案就來(lái)自材料，要求學(xué)生分析材料，找出試題設(shè)問(wèn)與材料中一致的內(nèi)容。如2009年安徽省高考卷第36題第一問(wèn)：依據(jù)材料一指出南宋和清朝前期外貿(mào)機(jī)構(gòu)的名稱(chēng)。通過(guò)閱讀材料可以很容易得到答案：廣南市舶（即市舶使），得居停十三行（即十三行）。這類(lèi)題型比較容易做答，但是許多同學(xué)都會(huì)犯同一個(gè)錯(cuò)誤，就是照抄材料，這樣答題在高考中是規(guī)定不給分的，所以學(xué)生要注意一定不要照抄材料的原文。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Games-Howell法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力影響碘酸鈉模型組A值(0.39±0.03)低于對(duì)照組A值(0.88±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木犀草素濃度梯度治療組A值[10 μmol·L-1組(0.69±0.06)、25 μmol·L-1組(0.74±0.09)、50 μmol·L-1組(0.84±0.06)、100 μmol·L-1組(0.70±0.05)]均高于碘酸鈉模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。木犀草素濃度在50 μmol·L-1時(shí)A值最高，該濃度為最佳有效濃度，后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)均以50 μmol·L-1作為木犀草素治療組濃度。

2.2 Hoechst 33342染色結(jié)果Hoechst 33342染色結(jié)果見(jiàn)圖1和表1，碘酸鈉模型組細(xì)胞核亮染率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木犀草素治療組細(xì)胞核亮染率低于碘酸鈉模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Hoechst 33342染色圖(×200)。A：對(duì)照組；B：碘酸鈉模型組；C：木犀草素治療組。凋亡細(xì)胞核為亮藍(lán)色，部分染色質(zhì)濃縮，呈碎塊狀或半月形致密染色

表1 各組ARPE-19細(xì)胞胞核亮染率和細(xì)胞凋亡率

組別細(xì)胞核亮染率/%細(xì)胞凋亡率/%對(duì)照組0.53±0.010.10±0.03碘酸鈉模型組28.27±1.44?33.19±1.45?木犀草素治療組10.94±1.41#11.87±1.84#

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與碘酸鈉模型組相比，#P<0.05

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和表1，碘酸鈉模型組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木犀草素治療組細(xì)胞凋亡率低于碘酸鈉模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 木犀草素調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)減輕ARPE-19細(xì)胞凋亡及炎癥Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3和表2，碘酸鈉模型組中炎癥通路相關(guān)蛋白HMGB1和NF-κB相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，木犀草素治療組HMGB1和NF-κB相對(duì)表達(dá)量均低于碘酸鈉模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；碘酸鈉模型組中凋亡途徑核心執(zhí)行蛋白cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木犀草素治療組cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)量低于碘酸鈉模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 OCT掃描結(jié)果OCT結(jié)果見(jiàn)表3和圖4，對(duì)照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列均一整齊，碘酸鈉模型組與木犀草素治療組RPE層均出現(xiàn)高反射點(diǎn)，光感受器和外核層排列紊亂、薄厚不均，但木犀草素治療組高反射點(diǎn)、光感受器、外核層紊亂程度均較碘酸鈉模型組輕，碘酸鈉模型組視網(wǎng)膜相對(duì)厚度低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木犀草素治療組視網(wǎng)膜相對(duì)厚度高于碘酸鈉模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果見(jiàn)圖5和表3，對(duì)照組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊，密度均勻，碘酸鈉模型組與木犀草素治療組外核層皺褶紊亂，呈波浪樣改變，RPE層部分?jǐn)嗔讶笔?，并可?jiàn)棕黑色顆粒(玻璃膜疣)沉積，但木犀草素治療組RPE斷裂程度及外核層皺褶程度均較碘酸鈉模型組輕，且碘酸鈉模型組玻璃膜疣數(shù)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木犀草素治療組玻璃膜疣數(shù)量低于碘酸鈉模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。A：對(duì)照組；B：碘酸鈉模型組；C：木犀草素治療組

圖3 Western blotting檢測(cè)HMGB1、NF-κB、cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)量。A：對(duì)照組；B：碘酸鈉模型組；C：木犀草素治療組

表2 各組ARPE-19細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量

組別蛋白相對(duì)表達(dá)量/%cleaved caspase-3HMGB1NF-κB對(duì)照組25.65±3.4845.28±2.308.51±0.70碘酸鈉模型組67.47±3.92?72.84±2.99?35.21±3.73?木犀草素治療組44.09±2.66#49.65±3.06#23.43±1.37#

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與碘酸鈉模型組相比，#P<0.05

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜相對(duì)厚度和玻璃膜疣數(shù)量

組別視網(wǎng)膜相對(duì)厚度/%玻璃膜疣數(shù)量對(duì)照組96.40±2.1218±4碘酸鈉模型組54.74±3.29?287±15?木犀草素治療組59.78±5.99#204±19#

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與碘酸鈉模型組相比，#P<0.05

圖4 小鼠視網(wǎng)膜OCT掃描結(jié)果。A：對(duì)照組；B：碘酸鈉模型組；C：木犀草素治療組

圖5 小鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果。A：對(duì)照組；B：碘酸鈉模型組；C：木犀草素治療組。黃色三角示RPE層棕黑色沉積物(玻璃膜疣)

3 討論

木犀草素是一種中藥單體，具有多種生物學(xué)特性，其抗炎、抗凋亡等特性被學(xué)者們廣泛提及，因此，本研究我們探討木犀草素對(duì)RPE細(xì)胞及小鼠視網(wǎng)膜的影響及其可能的機(jī)制。我們以碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19損傷細(xì)胞作為體外模型，發(fā)現(xiàn)在給予碘酸鈉處理時(shí)細(xì)胞活力顯著下降，而在給予不同濃度木犀草素處理后，能顯著降低碘酸鈉對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的抑制程度，與前人研究結(jié)果一致[16]，提示木犀草素濃度在10～100 μmol·L-1范圍內(nèi)能有效減輕碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷，同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)其濃度在10～50 μmol·L-1時(shí)，隨濃度增加細(xì)胞活力逐漸上升，50～100 μmol·L-1時(shí)隨濃度增加細(xì)胞活力逐漸下降，提示木犀草素濃度在50 μmol·L-1時(shí)效果最為顯著。雖然有研究者認(rèn)為木犀草素保護(hù)RPE細(xì)胞免受損傷的同時(shí)，亦能增加RPE細(xì)胞DNA損傷誘導(dǎo)的毒性[17]，但這可能與特定的細(xì)胞損傷模型有關(guān)。

早期干性AMD因多種因素導(dǎo)致RPE細(xì)胞功能受損，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[18]，而木犀草素具有顯著的抗凋亡特性[19]。我們使用Hoechst 33342染色發(fā)現(xiàn)，給予碘酸鈉處理后，ARPE-19細(xì)胞凋亡率顯著升高，而同時(shí)給予木犀草素后細(xì)胞凋亡率明顯降低；流式凋亡檢測(cè)也得到類(lèi)似結(jié)果，給予碘酸鈉處理后，細(xì)胞總凋亡率明顯升高，而同時(shí)給予木犀草素處理后細(xì)胞總凋亡率顯著降低。也有研究表明，木犀草素可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[20]，結(jié)果似乎與我們的研究有沖突，這可能是由于不同的細(xì)胞類(lèi)型和特定的細(xì)胞環(huán)境所導(dǎo)致的。綜合提示，木犀草素能抑制碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡。

木犀草素也有強(qiáng)大的抗炎作用，有報(bào)道稱(chēng)其能通過(guò)減少巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系、腸上皮細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[21-22]。NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、凋亡等病理生理過(guò)程，NF-κB作為炎癥反應(yīng)的核心，其上游HMGB1的促炎效應(yīng)就是通過(guò)與各種受體結(jié)合后，誘導(dǎo)NF-κB的移位、活化，刺激炎性因子產(chǎn)生，最后造成細(xì)胞損傷[23]，它們是導(dǎo)致炎癥通路激活的重要途徑，通過(guò)檢測(cè)HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，給予碘酸鈉刺激后，它們的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，同時(shí)給予木犀草素處理后相對(duì)表達(dá)量則顯著降低。據(jù)報(bào)道，許多重要的分子參與細(xì)胞凋亡進(jìn)展，cleaved caspase-3作為細(xì)胞凋亡最后核心的執(zhí)行者[24]，當(dāng)給予碘酸鈉處理時(shí)，cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)量明顯上升，而同時(shí)給予木犀草素處理后其相對(duì)表達(dá)量顯著下降，提示木犀草素能通過(guò)減輕HMGB1/NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)抑制碘酸鈉誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有木犀草素在體內(nèi)對(duì)RPE細(xì)胞或視網(wǎng)膜影響的研究，我們以碘酸鈉誘導(dǎo)的小鼠損傷視網(wǎng)膜為模型[25]，通過(guò)觀察視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)，測(cè)量視網(wǎng)膜厚度和比較RPE層玻璃膜疣數(shù)量，進(jìn)一步探索木犀草素在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否仍有效。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予碘酸鈉處理后，視網(wǎng)膜各層均出現(xiàn)不同程度損傷，且以RPE細(xì)胞層、光感受器和外核層為主，在給予木犀草素治療后，OCT顯示，RPE層高反射點(diǎn)減少，光感受器和外核層紊亂萎縮程度降低，并抑制視網(wǎng)膜相對(duì)厚度薄變；HE染色顯示，RPE層連續(xù)性有所提升，光感受器和外核層皺褶紊亂程度降低，并顯著減少了玻璃膜疣沉積數(shù)量，提示木犀草素在體內(nèi)能減輕碘酸鈉誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜損傷。

綜上所述，木犀草素通過(guò)降低HMGB1表達(dá)減輕NF-κB介導(dǎo)的炎癥，進(jìn)而抑制RPE細(xì)胞凋亡并減少視網(wǎng)膜損傷，提示木犀草素能作為一種潛在藥物用于干性AMD的治療。