于洋 劉學政

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)可引起神經(jīng)膠質(zhì)細胞損傷，表現(xiàn)為膠質(zhì)細胞增殖[1-2]。Müller細胞為視網(wǎng)膜最主要的膠質(zhì)細胞。在DR進程中，增殖的Müller細胞可分泌眾多細胞因子進而造成神經(jīng)元功能障礙[3]，誘發(fā)視網(wǎng)膜新生血管形成，從而抑制神經(jīng)元再生和突觸的重塑[4]。因此，抑制Müller細胞增殖可能有效減輕DR的發(fā)生發(fā)展。CDK抑制劑SCH727965可競爭細胞CDK的ATP結(jié)合位點，進而對增殖旺盛的細胞進行抑制，而對正常細胞的作用卻不明顯[5]。因此，抑制CDK的活性有可能降低Müller細胞過度增殖，從而促使神經(jīng)元損傷的恢復。本研究觀察SCH727965對糖尿病大鼠Müller細胞膠質(zhì)增殖及視網(wǎng)膜新生血管形成的影響，為其對DR發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器STZ(美國Sigma公司)；CDK抑制劑SCH727965(美國MCE公司)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì)(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde dehydrogenase,GAPDH)一抗 (英國Abcam公司)；熒光及Western blot二抗(北京碧云天公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.1.2 動物分組及模型制備雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～240 g[購自錦州醫(yī)科大學，SCXK(遼)2015-18]。隨機分為對照組、糖尿病組、治療組，每組各10只。后兩組單次腹腔注射55 mg·kg-1鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，72 h后檢測尾靜脈血糖，血糖>16.7 mmol·L-1的大鼠為糖尿病模型造模成功。模型誘導成功后，依據(jù)藥品說明書，治療組給予SCH727965 8 μL(3 nmol·L-1)玻璃體內(nèi)注射(雙側(cè)眼球均給藥)。對照組、糖尿病組注射等劑量PBS緩沖液。12 周后，進行各項指標檢測。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備12周后，每組取5只大鼠，40 g·L-1多聚甲醛灌注后取出雙側(cè)眼球，100 g·L-1、200 g·L-1、300 g·L-1梯度蔗糖溶液脫水，OCT包埋切片，厚度為12 μm，濕盒內(nèi)4 ℃保存，用于免疫熒光及免疫組織化學染色。另取每組5只大鼠麻醉處死分離出視網(wǎng)膜，裂解，冰上剪碎，4 ℃離心機離心30 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot檢測。

1.2.2 免疫熒光檢測大鼠視網(wǎng)膜GFAP、VEGF蛋白表達1.2.1中制備的切片PBS洗3次，每次3 min；體積分數(shù) 5%山羊血清+體積分數(shù)0.5% TritonX-100室溫孵育2 h，不洗；滴加兔抗大鼠GFAP(1600)、VEGF(1500)，4 ℃過夜，PBS洗4次，每次3 min；分別滴加山羊抗兔A488、山羊抗兔A594，室溫2 h，PBS洗4次，每次3 min；封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學檢測大鼠視網(wǎng)膜PEDF蛋白表達經(jīng)1.2.1制備的切片用PBS洗3次，每次5 min；體積分數(shù)3%H2O2室溫10 min，PBS洗3次，每次3 min；體積分數(shù)3%山羊血清室溫孵育30 min，不洗；滴加兔抗大鼠PEDF(1500)，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗，室溫30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加SABC試劑，室溫30 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，復染、脫水、透明封片后熒光顯微鏡拍照，并應用Image J軟件分析PEDF表達陽性率。

1.2.4 Western blot檢測大鼠視網(wǎng)膜GFAP、PCNA、PEDF蛋白相對表達量BCA法測定蛋白濃度，電泳時加入12 μL樣品；電泳、轉(zhuǎn)膜后10 g·L-1BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠GFAP，15000；兔抗大鼠PCNA，15000；兔抗大鼠PEDF，18000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗4次，每次5 min；加入二抗室溫2 h，孵育后TBST洗4次，每次5 min；化學發(fā)光法(chemiluminescence,ECL)顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，整體比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色檢測GFAP、VEGF蛋白表達將對照組GFAP、VEGF免疫熒光強度均設(shè)定為100.00%，熒光強度分析結(jié)果顯示：三組之間相比，總體差異均有統(tǒng)計學意義(F=689.32、795.14，均為P<0.05)。與對照組相比，糖尿病組GFAP、VEGF蛋白表達均明顯增加(均為P<0.01)；與糖尿病組相比，治療組GFAP、VEGF蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，見表1、圖1-圖2。

組別GFAP熒光強度/%VEGF熒光強度/%PEDF陽性率/%對照組100.00±0.00100.00±0.0038.26±0.52糖尿病組168.24±2.72a156.79±1.75a23.72±0.71a治療組124.37±3.01b118.36±1.98b32.52±0.63b

注：與對照組相比，aP<0.01；與糖尿病組相比，bP<0.05

2.2 免疫組織化學檢測PEDF蛋白表達PEDF表達陽性率檢測結(jié)果顯示：三組之間相比，總體差異具有統(tǒng)計學意義(F=1108.52，P<0.05)。與對照組相比，糖尿病組PEDF蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與糖尿病組相比，治療組PEDF蛋白表達明顯增加(P<0.05)，見表1、圖3。

圖1 免疫熒光檢測各組大鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白的表達(標尺：50 μm)。注：GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層

圖2 免疫熒光檢測各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF蛋白的表達(標尺：50 μm)。注：GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層

2.3 Western blot 檢測GFAP、PCNA、PEDF蛋白相對表達量三組GFAP、PCNA、PEDF蛋白表達相比，總體差異均具有統(tǒng)計學意義(F=465.02、496.37、452.19，均為P<0.05)。與對照組相比，糖尿病組GFAP、PCNA蛋白表達均明顯增加(均為P<0.01)，PEDF蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與糖尿病組相比，治療組GFAP、PCNA蛋白表達均明顯降低(均為P<0.05)，PEDF蛋白表達明顯增加(P<0.05)，見表2、圖4。

圖3 免疫組織化學染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜PEDF蛋白的表達(標尺：50 μm)。A:對照組；B:糖尿病組；C:治療組。GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層

組別GFAP/%PCNA/%PEDF/%對照組7.25±0.329.34±0.4710.95±0.29糖尿病組17.85±0.36a16.11±0.34a6.38±0.22a治療組11.71±0.41b12.05±0.67b8.22±0.36b

注：與對照組相比，aP<0.01；與糖尿病組相比，bP<0.05

圖4 Western blot檢測GFAP、PCNA、PEDF蛋白相對表達量。A:對照組；B:糖尿病組；C:治療組

3 討論

DR狀態(tài)下Müller細胞的膠質(zhì)增殖可引起視網(wǎng)膜變性，從而打破視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境的平衡，對視網(wǎng)膜神經(jīng)元造成損傷[6]。因此，在DR早期抑制Müller細胞膠質(zhì)增殖，對防治DR尤為重要。GFAP為中間絲骨架蛋白，研究證實，GFAP與視網(wǎng)膜Müller細胞膠質(zhì)增殖密切相關(guān)[7-8]，可作為Müller細胞增殖活化的標志物。PCNA又稱周期蛋白，其表達量的改變與DNA合成狀態(tài)一致，可用來評估細胞增殖狀態(tài)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，DR狀態(tài)下GFAP、PCNA表達明顯增加，說明DR可造成Müller細胞增殖活化。而SCH727965是一種有效的選擇性CDK抑制劑，可抑制 CDK2、CDK5、CDK1和CDK9，使細胞周期停滯于G1/S和G2/M轉(zhuǎn)折點，進而抑制DNA的合成，使細胞增殖狀態(tài)降低。有學者發(fā)現(xiàn)，SCH727965可通過抑制CDK2和CDK9的活性，對神經(jīng)母細胞瘤的異常增殖具有良好的療效[10]。而本研究中在給予CDK抑制劑SCH727965后，GFAP、PCNA表達明顯降低，說明SCH727965可在一定程度上抑制Müller細胞增殖，可能對減輕DR具有重要作用。

視網(wǎng)膜新生血管形成為DR損傷的重要表現(xiàn)[11]。VEGF可促進視網(wǎng)膜新生血管的形成，而PEDF可抑制新生血管的形成，VEGF和PEDF間的平衡與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。DR時VEGF表達增加，PEDF表達降低，共同加重了DR的發(fā)展進程[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，DR狀態(tài)下VEGF表達明顯上調(diào)，PEDF表達明顯下調(diào)。而VEGF表達增加及PEDF表達降低的原因可能是由于：(1)高血糖引起視網(wǎng)膜微環(huán)境紊亂可使VEGF表達上調(diào)，PEDF表達下調(diào)；(2)隨著DR進程延長，視網(wǎng)膜缺血、缺氧，亦可上調(diào)VEGF，下調(diào)PEDF的表達。二者相互作用，最終打破VEGF和PEDF之間的動態(tài)平衡，誘發(fā)新生血管形成。而給予SCH727965后VEGF表達降低，PEDF表達增加，同時，GFAP、PCNA表達明顯降低，提示SCH727965可抑制Müller細胞增殖，進而減少視網(wǎng)膜新生血管的形成，對DR狀態(tài)下Müller細胞的損傷起到抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，SCH727965可下調(diào)DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜GFAP、VEGF、PCNA表達，上調(diào)PEDF表達，進而抑制Müller細胞增殖，最終減少視網(wǎng)膜新生血管形成。但因DR致病機制復雜，SCH727965的臨床價值及球內(nèi)注射是否存在副作用仍需深入研究探討。