劉靜 雷春靈 白淑瑋 張磊 陳莉

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是造成視網(wǎng)膜脫離復位手術失敗的主要原因[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細胞是參與PVR形成最重要的細胞成分之一。在正常生理條件下，RPE細胞處于相對靜止的非增殖狀態(tài)[2]，但在一些病理條件下RPE細胞會重新進入細胞周期，發(fā)生增殖與遷移，該過程是PVR的主要病理過程[3-4]。

近年來越來越多的研究證實，miRNA與眼部疾病的發(fā)生與發(fā)展存在密切聯(lián)系[5-6]。人們開始關注miRNA在人類疾病中的作用以及將其作為治療手段的可能性。在眾多的miRNA中，miR-29b與細胞增殖、細胞周期調(diào)控、細胞遷移及纖維化過程的多種重要的細胞生理過程密切相關。隨著人們對PVR深入地研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與PVR的發(fā)生與發(fā)展有關。最新研究表明，血管平滑肌細胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中miR-29b分別通過ERK/Akt以及Smad信號通路抑制細胞的增殖和移行[7-8]。但未見關于miR-29b在PVR動物及細胞模型中的研究報道，因此，本研究擬通過凝血酶刺激人RPE細胞增殖模擬體外PVR建模，利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法和免疫印跡實驗(Western blot)技術，以微管相關蛋白1輕鏈3(light chain 3，LC3)Ⅱ為檢測標志，研究調(diào)控miR-29b干預自噬水平介導人RPE細胞增殖的作用和機制，為尋求PVR的基因水平治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人RPE細胞系ARPE19 (CRL-2302；American Type Culture Collection，Manassas，VA，美國)，CO2培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，超凈工作臺(Artech，美國)，540型酶標儀(BIO-RAD，美國)，熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)，Trizol (Invitrogen，美國)，兔源性LC3B多克隆抗體、兔源性β-actin多克隆抗體(Gene Tex，美國)，山羊抗兔IgG/辣根酶標記(北京中杉金橋)，MTT(Applichem，美國)，慢病毒表達質(zhì)粒 pMIR-miR-29b(上海吉凱基因)，2.5 g·L-1胰蛋白酶、胎牛血清、B27 神經(jīng)元培養(yǎng)添加劑、DMEM培養(yǎng)基等(Gibco，美國)。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞系ARPE19傳代和培養(yǎng)將ARPE19細胞系放入37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)復蘇、培養(yǎng)，采用酶消化法按13比例傳代培養(yǎng)，傳代8 h后細胞大部分貼壁生長，24 h后細胞全部貼壁，倒置相差顯微鏡下每天觀察細胞的生長情況和形態(tài)特征，ARPE19細胞系貼壁生長密度接近80%～90%時，更換培養(yǎng)液。所有細胞均使用DMME培養(yǎng)基+體積分數(shù)10% 胎牛血清+5 mmol·L-1葡萄糖+10 g·L-1青-鏈霉素常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 RPE細胞感染效率測定在感染前24 h鋪板，6孔板中鋪RPE細胞，每孔約106個，2 mL完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清)。感染時給細胞更換新鮮的培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清)，同時加入含適量病毒顆粒和終濃度為5 mg·L-1Polyrene(聚凝胺)增加病毒轉染效率。24 h后換液為完全培養(yǎng)基 (含體積分數(shù)3%胎牛血清和10 g·L-1青-鏈霉素)。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。感染后24～72 h在熒光顯微鏡下觀察RPE細胞感染效率。

1.2.3 凝血酶誘導RPE細胞增殖及分組選擇生長良好的第3-5代RPE細胞用于本實驗。細胞去血清12 h進行同步化。加入含凝血酶的無血清培養(yǎng)液200 μL，凝血酶以無血清培養(yǎng)液稀釋，其藥物終濃度根據(jù)文獻[9]選擇為0.5×103U·L-1，刺激時間為1 h。凝血酶刺激成功后分別加入miR-29b和Lenti-vector空載體刺激24 h。隨機分為空白對照組(Sham組)、凝血酶刺激組(RPE組)、凝血酶刺激組+miR-29b過表達組(RPE+Lenti-29b組)、凝血酶刺激組+空載體組(RPE+Lenti-vector組)。

1.2.4 RPE細胞增殖測定RPE細胞的增殖測定采用MTT比色法來進行。96孔板每孔加入20 μL MTT 溶液，在細胞培養(yǎng)箱37 ℃下孵育4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液，酶標儀在490 nm測定各孔吸光度(A)值。以空白對照組細胞活力為100%，細胞存活率計算用下面的公式：細胞存活率=A處理組/A空白對照組×100%。

1.2.5 實時定量PCR檢測has-miR-29b的表達效率收集穩(wěn)定過表達重組載體has-miR-29b及空白對照和陰性對照質(zhì)粒的 RPE細胞，使用Trizol提取細胞中的總RNA，具體操作按照Trizol說明書進行。提取的總 RNA測定濃度后，M-MLV反轉錄 RNA獲得 cDNA，所用特異性逆轉錄引物：內(nèi)參U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’；miR-29b上游引物：5’-CTGG CGTAGCACCATTTGAAAT-3’，下游引物：5’-CAGTGCAGGGTCCG AGGT-3’。所得結果采用2-ΔΔCt計算其相對定量值。

1.2.6 Western blot檢測LC3Ⅱ蛋白表達收集各組處理過的RPE細胞，在RIPA緩沖液中裂解(10 g·L-1Nonidet P-40、5 g·L-1脫氧膽酸鈉、1 g·L-1PBS SDS)，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白(50 μg)加入到120 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉移到硝酸纖維素膜上，纖維膜使用50 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h，然后與LC3II(13000)抗體結合，4 ℃過夜；TBST沖洗30 min，與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，室溫孵育1 h；電化學發(fā)光法顯色后照相。最后用凝膠成像系統(tǒng)(Image master VDS)攝影，圖像分析軟件(Image J) 行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對量，并使用掃描圖像分析儀計算蛋白條帶的表達。

2 結果

2.1 miR-29b在RPE細胞中的感染效率及mRNA表達倒置熒光顯微鏡觀察RPE+Lenti-29b組和RPE+Lenti-vector組細胞可見，90%以上的RPE細胞都有綠色熒光標記 (圖1)。實時定量PCR檢測結果顯示，與RPE+Lenti-29b組比較，Sham組的miR-29b明顯低表達(P<0.01)，而RPE組和RPE+Lenti-vector組miR-29b表達較低(均為P<0.05)；與Sham組比較，RPE組和RPE+Lenti-vector組miR-29b呈高表達，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

圖1 免疫熒光下觀察Lenti-29b對RPE細胞的感染率

2.2 miR-29b對RPE細胞增殖和活力的影響凝血酶對RPE細胞刺激后，可以明顯增加RPE的增殖能力，與Sham組比較，RPE組和RPE+Lenti-vector組RPE細胞增殖分別增強了3.30倍、3.37倍(均為P<0.01)，RPE+Lenti-29b組RPE細胞增殖增加了2.30倍(P<0.01)；通過Lenti-29b成功轉染RPE細胞后，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-29b表達對RPE細胞增殖有明顯的抑制作用，與RPE組相比，RPE+Lenti-29b組細胞增殖下降了30%(P<0.05)。

2.3 miR-29b對RPE細胞中LC3Ⅱ蛋白表達的影響Western blot結果提示，凝血酶刺激RPE后，與Sham組相比，RPE組、RPE+Lenti-vector組和RPE+Lenti-29b組RPE細胞中LC3II蛋白表達均顯著提高(均為P<0.05)。但與RPE+Lenti-29b組比較，RPE組和RPE+Lenti-vector組RPE細胞中LC3Ⅱ蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。而RPE組和RPE+Lenti-vector組比較，RPE細胞中LC3II蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 miR-29b對RPE細胞中LC3Ⅱ蛋白表達的影響

3 討論

PVR是一種由于病理性細胞在玻璃體后表面和視網(wǎng)膜內(nèi)外兩側廣泛增殖和收縮而形成視網(wǎng)膜前膜、視網(wǎng)膜下膜及橫跨玻璃體的膜狀病理改變[10-11]，其中RPE細胞的增殖、遷移造成上皮細胞向間質(zhì)細胞轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的過程是PVR的主要病理過程[12-13]。因此，闡明RPE細胞在EMT中的基因、分子病理機制顯得尤為重要。

Parrales等[9]研究證實，在凝血酶刺激下RPE細胞通過mTORC1/p70S6K信號通路進行增殖、移行以來，RPE細胞自噬水平及發(fā)生機制成為研究PVR的重點和熱點。自噬又被稱為Ⅱ程序性細胞死亡[14-15]，生理情況下，細胞存在低水平自噬，以維持細胞正常代謝、穩(wěn)態(tài)和內(nèi)環(huán)境。當自噬發(fā)生時，LC3-Ⅱ蛋白始終位于細胞內(nèi)自噬體膜上，其含量與自噬泡數(shù)量成正比[12]，所以LC3Ⅱ蛋白表達的高低與發(fā)生自噬的程度成正比。已有研究提示[9]，參與RPE細胞EMT的信號通路主要有mTOR/mTORC1/p70S6K信號通路、Akt信號通路、Smad3/Smad7信號通路以及Notch信號通路，這些信號通路通過改變細胞內(nèi)LC3Ⅱ蛋白的表達調(diào)控自噬泡數(shù)量，與細胞自噬密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，凝血酶刺激RPE細胞增殖過程中，RPE細胞內(nèi)LC3Ⅱ蛋白表達水平顯著提高，提示凝血酶可激活RPE細胞自噬，而自噬促進了RPE細胞的增殖和遷移，在PVR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這一結論與文獻報道一致[9]。但其更深入的基因、分子病理機制尚不清楚。

進一步研究我們發(fā)現(xiàn)，miR-29b可能單獨或聯(lián)合凝血酶參與RPE細胞自噬的病理過程。miRNA是一組由動物、植物和病毒基因組所編碼的單鏈小RNA，其通過與靶mRNA3’-UTR的堿基互補配對結合而使其降解或抑制其翻譯，從而導致特定基因的沉默，對機體生長、發(fā)育和各種疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)功能[16]。本實驗結果顯示，凝血酶刺激RPE細胞增殖模擬PVR模型中，miR-29b高表達，LC3Ⅱ蛋白高表達，細胞自噬水平高，提示miR-29b表達與自噬水平呈正相關，但是否參與自噬的發(fā)生還不清楚。進一步利用慢病毒表達質(zhì)粒感染RPE細胞，即上調(diào)miR-29b表達后，與RPE組和RPE+Lenti-vector組比較，LC3Ⅱ蛋白表達更高，細胞自噬水平也明顯提高，提示miR-29b可能單獨通過調(diào)控mTOR信號通路和Akt信號通路等影響LC3Ⅱ蛋白表達，激活RPE細胞自噬；也有可能被凝血酶激活后，調(diào)控自噬相關信號通路介導 RPE細胞增殖，參與PVR的發(fā)生發(fā)展。而miR-29b作為PVR潛在干預靶點，有待于今后進一步研究。

綜上所述，在建立凝血酶刺激RPE細胞增殖模擬PVR模型中，上調(diào)miR-29b表達、激活LC3Ⅱ蛋白表達、提高細胞自噬水平及抑制RPE細胞增殖均可能在PVR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這些研究結果將有助于深入了解miRNA對PVR疾病中RPE細胞增殖遷移機制的了解，并可能為其治療提供新的思路和作用靶點。