周海燕 薛雨順 王新川 李迪 高寧寧

晶狀體蛋白質(zhì)是晶狀體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，多種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可引起晶狀體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、溶解度改變，晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生凝集、交聯(lián)，影響光散射的不溶性蛋白質(zhì)聚集于晶狀體中央，導(dǎo)致光散射和晶狀體透明度改變，進(jìn)而引起視力下降。大量研究已證實(shí)，蛋氨酸(methionine，Met)對維持晶狀體透明度非常重要，甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(betaine-homocysteine methyl transferase，BHMT)是Met循環(huán)中重要的酶。BHMT 主要在肝臟和腎皮質(zhì)中大量表達(dá),它利用同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜堿(betaine，Bet)催化 Met 的再合成[1-2]。Hcy在血清中的含量隨年齡增長而升高，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激源。而高 Hcy 是導(dǎo)致年齡相關(guān)性疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。除此之外，還與多種眼部疾病相關(guān)[4]。在白內(nèi)障的研究中，高水平的 Hcy與青少年白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)密切相關(guān)[5-6]。本研究通過BHMT干預(yù)Hcy孵育下的大鼠離體晶狀體，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白、細(xì)胞內(nèi)ROS、抗氧化酶及凋亡相關(guān)蛋白的變化，探討B(tài)HMT在高濃度Hcy環(huán)境下對晶狀體的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級6周齡SD大鼠28只，雌雄各半。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白相關(guān)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)試劑盒、Caspase-12試劑盒(美國Abcam公司)，抗氧化損傷類蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)試劑盒(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，DCFH-DA、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(中國碧云天公司)。PBS緩沖液、Tris HCL緩沖液(pH 7.3)、β-巰基乙醇 0.2 mL考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸 2.9 g、十二烷基磺酸鈉、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、苯甲基磺酰氟、吲哚乙酸、尿素(美國Amresco公司)，Dissolution Buffer液(美國Applied Biosystem公司),Bradford蛋白濃度測定試劑盒(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法大鼠28只(56眼)，頸椎脫臼法處死后取出雙眼眼球，在顯微鏡下完整分離晶狀體后分4組 (每組7只14眼)，分別為正常組(A組)、BHMT組(B組)、Hcy+BHMT組(C組)、Hcy 組(D組)。A組:孵育在25 mol·L-1高糖-DMEM培養(yǎng)基；B組：孵育在 25 mol·L-1高糖-DMEM+BHMT (110 000 稀釋液0.5 mL)培養(yǎng)液；C組：首先孵育在 25 mol·L-1高糖-DMEM+BHMT(110 000稀釋液0.5 mL)培養(yǎng)液中12 h，然后PBS液洗脫 BHMT 3次后再加入5 mol·L-1Hcy 0.5 mL；D組：孵育在25 mol·L-1高糖-DMEM+0.5 mL的5 mol·L-1Hcy 培養(yǎng)液[7]。每組孵育 24 h后，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 觀察晶狀體透明度的改變?nèi)〕龈鹘M晶狀體，于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗后置于無菌玻璃培養(yǎng)皿中，觀察各組晶狀體混濁度，并用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。

1.3.2 相關(guān)蛋白質(zhì)檢測利用Western blot檢測以下蛋白質(zhì)的表達(dá)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78，抗氧化損傷類蛋白質(zhì)Nrf2、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)、凋亡相關(guān)酶Caspase-12。晶狀體研磨后，進(jìn)行超聲粉碎。取上清 BCA 法測定蛋白濃度。加樣進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及脫脂牛奶封閉，之后于 4 ℃ 冰箱內(nèi)與一抗孵育過夜，室溫漂洗后給予二抗孵育 1 h，再次漂洗后加入配好的顯色液。凝膠成像分析系統(tǒng)顯影。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測用撕囊鑷自赤道部小心撕取大鼠晶狀體前囊膜,制作大鼠晶狀體上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液,無水乙醇溶解DCFH-DA(終濃度20 mol·L-1),每個(gè)樣品收集10×103個(gè)細(xì)胞,37 ℃避光負(fù)載 30 min,使用流式細(xì)胞儀行DCFH-DA定量檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組結(jié)果均重復(fù)測3次，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 晶狀體透明度的改變體外培養(yǎng)24 h后可見：A、B組晶狀體透明，D組晶狀體混濁，C組晶狀體較D組混濁程度有所減輕(圖1)。

2.2 各組GRP78、Nrf2、GR、Caspase-12蛋白表達(dá)體外培養(yǎng)24 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示：GRP78蛋白的相對表達(dá)量：A、B、C、D組分別為 0.108 1±0.021 0、0.128 2±0.013 0、0.230 5±0.021 2、1.023 5±0.303 5。D組表達(dá)量明顯高于A、B、C組,與其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而C組與A、B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖2。

Nrf2蛋白的相對表達(dá)量：A、B、C、D組分別為0.503 3±0.022 0、0.621 2±0.023 0、0.531 2±0.011 1、0.100 5±0.013 5。D組表達(dá)量明顯低于A、B、C組,與其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而C組與A、B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，見圖3。

GR蛋白的相對表達(dá)量：A、B、C、D組分別為0.712 2±0.041 0、0.600 3±0.023 0、0.630 1±0.002 1、0.126 2±0.013 5。D組表達(dá)量明顯低于A、B、C組,與其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而C組與A、B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖4。

Caspase-12蛋白的相對表達(dá)量：A、B、C、D組分別為0.050 1±0.011、0.121 2±0.033、0.237 5±0.021 2、1.017 5±0.063 5。D組表達(dá)量明顯高于A、B、C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而C組與A、B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖5。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測體外培養(yǎng)24 h后，使用流式細(xì)胞儀行細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA定量檢測顯示,A、B、C、D組熒光強(qiáng)度分別為(55.025 0±0.131 0)%、(58.012 3±0.231 0)%、(63.362 5±0.250 2)%、(98.150 2±0.260 6)%。D組明顯高于A、B、C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而C組與A、B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖6。

圖1 大鼠晶狀體混濁度的改變。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖2 大鼠晶狀體GRP78蛋白的Western blot分析結(jié)果。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖3 大鼠晶狀體Nrf2蛋白的Western blot分析結(jié)果。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖4 大鼠晶狀體GR蛋白的Western blot分析結(jié)果。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖5 大鼠晶狀體Caspase-12蛋白的Western blot分析結(jié)果。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖6 大鼠晶狀體細(xì)胞內(nèi) ROS 水平檢測。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

3 討論

前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了不同年齡人群白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì),并首次報(bào)道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進(jìn)一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標(biāo)本進(jìn)行了驗(yàn)證[8]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機(jī)制尚未完全清楚。在胎兒晶狀體文庫中，BHMT 是一個(gè)大量表達(dá)的基因[9]。Rao等[10]第一次在恒河猴的晶狀體核中發(fā)現(xiàn)了BHMT，其表達(dá)占核部總蛋白的0.5%～10.0%，作者推測其和Met的代謝相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。BHMT主要在肝臟和腎皮質(zhì)中有較大量表達(dá),它利用Hcy和Bet催化Met的再合成[1-2]。Hcy是Met循環(huán)過程中的中間代謝產(chǎn)物。高Hcy除了與心血管疾病、神經(jīng)性疾病、糖尿病等全身疾病相關(guān)外，與白內(nèi)障等眼部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。有研究認(rèn)為，高濃度Hcy可以誘導(dǎo)晶狀體細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展[7,11]。Hcy升高導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和凋亡,可能導(dǎo)致了皮質(zhì)性白內(nèi)障的形成[12]。而后囊下白內(nèi)障的形成可能與玻璃體內(nèi)Hcy的含量增多有關(guān)[13]。遺傳性高胱氨尿酸患者心血管疾病、白內(nèi)障、青光眼疾病高發(fā)，被認(rèn)為Hcy是造成機(jī)體老化的重要因素，血清中大約80%Hcy通過二硫鍵與纖維連接蛋白或白蛋白結(jié)合[14]，但其余20%游離于血清中存在很長時(shí)間[15]。游離的Hcy被半胱氨酸膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)化入晶狀體細(xì)胞[16]，高濃度Hcy可造成晶狀體細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，其作用機(jī)制被認(rèn)為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。Hcy誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力,啟動了UPR，并導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生而降低了游離谷胱甘肽的數(shù)量,削弱了氧化防御系統(tǒng)，加劇了氧化的環(huán)境,導(dǎo)致晶狀體發(fā)生氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在相同的誘導(dǎo)條件下BHMT轉(zhuǎn)基因小鼠的高Hcy血癥發(fā)病率明顯低于對照組，并可保護(hù)肝臟細(xì)胞免受高同半胱氨酸濃度的損傷[17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)兩種 miRNAs 通過分化靶向海刺參中BHMT來直接影響體腔細(xì)胞中Hcy含量，靶基因BHMT siRNA或補(bǔ)充Hcy均可明顯促進(jìn)體腔細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，表明靶基因BHMT通過調(diào)控Hcy的含量發(fā)揮生物學(xué)功能。我們用5 mol·L-1Hcy培養(yǎng)晶狀體24 h。Western blot分析顯示，24 h的暴露足以誘導(dǎo)HLECs中UPR特異性蛋白的表達(dá)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,加入BHMT干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平較Hcy單純處理組明顯降低,Nrf2作為重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子被激活后表達(dá)明顯增加，發(fā)揮了抗氧化性能，明顯減輕了晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷，抑制了Caspase-12的表達(dá)，最終表現(xiàn)為晶狀體混濁度減輕。BHMT在體外可以有效防護(hù)高Hcy環(huán)境下晶狀體氧化損傷,清除ROS,阻止細(xì)胞凋亡,證明了其在防治與Hcy有關(guān)的疾病方面的積極作用，將為白內(nèi)障氧化損傷機(jī)制提供新的依據(jù)。