毛 娟，王小雨

(東北師范大學環(huán)境學院，長春 130117)

1 引 言

硫是生物體生存的必需營養(yǎng)元素之一[1]，生物體內的硫主要以還原態(tài)的形式在有機硫醇物質中存在[2]。硫酸鹽同化是指硫酸鹽在生物作用下合成為有機硫化物的過程，即首先將硫酸鹽中的硫轉變?yōu)檫€原態(tài)的硫，并將其加入到生物體的含硫代謝物，如半胱氨酸和胱氨酸等有機硫化物中，構成生物的細胞組分。大多數(shù)微生物和植物均可參與這一過程。硫酸鹽同化途徑的產物半胱氨酸是無機硫元素最終轉變?yōu)橛袡C硫并參與生物體代謝的中間載體[3]，在生物代謝中發(fā)揮重要作用：參與生物體必需氨基酸甲硫氨酸的轉變；參與硫胺素、生物素、鐵硫簇、輔酶A及輔酶M的合成；是生物體重要抗氧化劑谷胱甘肽、硫蛋白等的合成原料之一[4]。此外，半胱氨酸和甲硫氨酸殘基具有修復細菌細胞質和細胞膜氧化損傷的作用[5]，半胱氨酸生物合成的抑制會嚴重干擾病原體抵抗氧化應激[6]?？梢姡蛩猁}同化在生物體代謝中具有重要作用。

近年來組學的研究發(fā)現(xiàn)硫酸鹽同化參與了微生物的重金屬抗性作用。已經(jīng)出現(xiàn)了幾篇關于微生物硫酸鹽同化的綜述，如David Mendoza-Co′zatl等人[7]綜述了重金屬鎘脅迫對真核生物的酵母、原生植物和高等植物硫酸鹽同化途徑的影響及其衍生物谷胱甘肽的解毒作用；Carlo Viti等人[8]指出細菌和真菌中硫代謝相關基因在鉻脅迫下顯著表達；鄭春麗[9]綜述了微生物硫酸鹽同化途徑與重金屬抗性的關系。然而，已有的綜述多側重硫酸鹽同化途徑的過程機理闡述，有關微生物硫酸鹽同化途徑調控的綜述還很少見，尤其是重金屬脅迫下微生物硫酸鹽同化途徑是如何調控的以及硫酸鹽同化在微生物重金屬抗性中如何發(fā)揮作用還未有明確的綜述。因而，對微生物硫酸鹽同化的綜述有助于進一步了解微生物的重金屬抗性機制，同時為揭示微生物硫酸鹽同化途徑及其與重金屬抗性的關系提供參考。本文針對微生物體內硫酸鹽同化途徑的調控及其在重金屬抗性中的作用進行總結。

2 微生物硫酸鹽同化途徑

2.1 微生物硫酸鹽同化途徑

微生物硫酸鹽同化通常是指微生物將硫酸鹽經(jīng)活化、還原、合成半胱氨酸的過程，這一過程亦稱作同化型硫酸鹽還原。微生物硫酸鹽同化途徑是微生物體內硫代謝的重要組成部分，是合成生物體代謝所必需的含硫氨基酸的必需前提。硫酸鹽同化途徑在植物、真菌、細菌和古細菌之間廣泛保守，不同界生物間存在細微差別[10]。在真核微生物的釀酒酵母中研究較為透徹，主要是因為酵母菌經(jīng)常作為生物工程菌生產一些含硫氨基酸或發(fā)酵生產葡萄酒等；革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌中亦有相似的應用。

2.2 微生物硫酸鹽同化途徑代謝通路

微生物硫酸鹽同化途徑包括：硫酸鹽的轉運、活化、還原以及半胱氨酸合成，其同化機理如圖1(A)。

(1)轉運 環(huán)境中的硫酸鹽通過主動運輸?shù)姆绞竭M入生物體細胞內。一般來說，優(yōu)選的硫源是無機硫酸鹽[11]。已知4種細菌轉運蛋白可運輸硫酸鹽和結構類似的硫代硫酸鹽：SulT家族；SulP家族；PiT家族的CysP轉運蛋白和CysZ轉運蛋白[12]，如圖1(A)。Q在微生物培養(yǎng)過程中硫酸鹽是最受歡迎與常用的硫源，例如，硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鎂等硫酸鹽[13]。除硫酸鹽是細菌的優(yōu)選硫源外，土壤環(huán)境也含有豐富的磺酸鹽和硫酸酯[14]。已知細菌中有兩類有機硫轉運蛋白TauABC和SsuABC，分別負責轉運?；撬岷屯榛撬醄15]，如圖1(B)。此外，許多微生物也可以吸收非氨基酸的有機硫化合物，如亞砜，砜，磺酸鹽和硫酸酯等。這些化合物在經(jīng)過硫酸酯酶水解后以硫酸鹽或亞硫酸鹽形式釋放，再進入無機硫酸鹽同化途徑，以滿足微生物對硫的需求。

(A: 微生物無機硫酸鹽同化途徑通路，根據(jù)Takeshi Nakatani等人文獻[17] 繪制；EC 2.7.7.4，ATP硫?；福?EC 2.7.1.25，APS還原酶；EC 1.8.4.8，PAPS還原酶；EC 1.8.1.2，亞硫酸鹽還原酶；EC 2.5.1.47，半胱氨酸合成酶；APS：腺苷-5’-磷酰硫酸；PAPS：3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。B: 微生物硫轉運蛋白，根據(jù)Esther Aguilar-Barajas等人[12]和Eric Eichhorn等人[18]文獻繪制；taurine：?；撬?；alkanesulfonate：鏈烷磺酸鹽。) 圖1 微生物硫酸鹽同化途徑及硫轉運蛋白Fig.1 Microbial sulfate assimilation pathway and sulfur transporter

(2)活化 進入生物體的硫酸鹽在基因cysDN編碼的ATPS(ATP硫?；福珽C 2.7.7.4)作用下活化為腺苷-5’-磷酰硫酸(APS)。許多細菌中，如大腸桿菌和腸道沙門氏菌中，cysC編碼的APS還原酶(EC 2.7.1.25)進一步作用于APS，其將APS轉化為3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)。

(3)還原 PAPS通過cysH編碼的PAPS磺基轉移酶(PAPS還原酶，EC 1.8.4.8)從PAPS中釋放亞硫酸鹽和3’，5’二磷酸腺苷酸(PAP)，再通過亞硫酸鹽還原酶(EC 1.8.1.2)將亞硫酸鹽還原為硫化物。

(4)半胱氨酸合成 硫酸鹽同化的最后一步是將硫化物整合入半胱氨酸。硫化物與O-乙酰基-L-絲氨酸(OAS)結合形成L-半胱氨酸，該反應由兩種OAS裂解酶(也稱半胱氨酸合成酶，EC 2.5.1.47)同功酶CysM或CysK中的一種催化[16]。

3 微生物硫酸鹽同化途徑的調控

3.1 微生物硫酸鹽同化途徑的代謝調控

生物具有保持相對恒定細胞內環(huán)境的能力。生物存在代謝和遺傳控制機制，以使生物體適應胞外環(huán)境的變化。細胞控制機制通過關鍵酶活的調節(jié)(激活或抑制)實現(xiàn)[7]。一種方式是通過與一些代謝物和共價酶修飾的非共價相互作用組成的短期(生物化學)機制，是酶活性的調節(jié)；另一種方式是由酶的合成和降解速率變化組成的長期(遺傳)機制，是酶合成的調酶活性的調節(jié)是生物體一種快速、精細的調節(jié)方式。目前已有研究中，對微生物硫酸鹽同化途徑代謝調節(jié)的研究主要集中在外加(減)硫源或中間代謝物對關鍵酶活性的影響方面。

其次，中間代謝產物對關鍵酶活的影響。在結核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis中，硫活化階段的產物PAPS可在磺基轉移酶的作用下產生PAP， PAP過量會抑制磺基轉移酶的活性，因而抑制硫酸鹽活化過程[22]。給Saccharomycescerevisiae提供富含半胱氨酸、甘氨酸的培養(yǎng)基導致GSH合成速度短期快速增加，但GSH合成酶基因表達下降。幾小時后GSH1表達水平和GSH合成速率恢復基礎水平。這些結果表明，較高濃度的GSH合成的控制發(fā)生在酶水平而不是轉錄水平。另一方面，培養(yǎng)基中半胱氨酸的補充導致硫酸鹽同化途徑相關基因下調[23]。這表明硫酸鹽同化途徑一般受其中間代謝產物或半胱氨酸衍生物的抑制。

3.2 微生物硫酸鹽同化途徑的遺傳調控

除了硫源或中間代謝物對硫酸鹽同化途徑關鍵酶活的影響，微生物硫酸鹽同化途徑也受到相關功能基因遺傳調控。

大量研究通過構建突變體的方式結合微生物硫源利用能力分析進行研究。Tomas Linder[24]研究了巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris無機硫酸鹽同化途徑中的兩個關鍵基因MET3(編碼酶ATP硫酸化酶)和MET5(編碼亞硫酸鹽還原酶)，通過構建缺失突變體檢測利用氨基磺酸鹽和其他硫源的能力。MET3基因的缺失不影響對L-甲硫氨酸，亞硫酸鹽，甲磺酸鹽或牛磺酸的利用，但在硫酸鹽，甲基硫酸鹽和氨基磺酸鹽上的生長抑制。缺失MET5基因菌株在除L-甲硫氨酸以外的所有測試硫源上均不生長。這些結果表明，氨基磺酸的分解代謝在其同化前通過硫酸鹽中間體進行。Zu-Jun Lu[25]等人通過突變體創(chuàng)建和單一硫源(硫酸鹽和甲硫氨酸)利用分析的方法識別了費氏中華根瘤菌SinorhizobiumfrediiHN01中一個關于硫酸鹽同化的操縱子，其中基因cysG，cysI與其他根瘤菌同源，并且新注釋一個基因cysII。Marco Fischer等人[26]也通過這種方式識別了放線桿菌StreptomycescoelicolorA3中的sirA基因，其用于編碼亞硫酸鹽還原酶。S.frediiWGF03的SiRI 突變菌株不能用利用亞硫酸鹽作為唯一硫源，而互補菌株CSiRI 與野生型菌株卻可以，結果證實了亞硫酸還原酶確實與亞硫酸鹽同化途徑有關[27]。宋張揚等人[28-29]利用轉座子插入法構建了S.fredii15142的cysDN突變菌株，在利用硫源時受到限制，不能利用硫酸鹽，能利用其他無機硫源(亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽)和有機硫源(半胱氨酸和甲硫氨酸)，而互補菌株基本不受影響。在S.frediiWGF03[30]、S.frediiHN01、苜蓿中華根瘤菌14 500(均為快生根瘤菌)亦有相似結果，但是在大豆慢生根瘤菌15606(屬慢生根瘤菌)呈現(xiàn)不同趨勢，其cysDN突變株利用硫酸鹽能力并未改變。推測這兩種根瘤菌的硫活化機制存在不同。這些研究表明，對微生物硫酸鹽同化途徑相關基因進行突變后，微生物硫源利用能力發(fā)生改變，從而證實了相關基因在硫酸鹽同化途徑中的功能。

另外，近年來相關基因或蛋白調控硫酸鹽同化途徑的也有報道。丁香假單胞菌Pseudomonassyringae和惡臭假單胞菌Pseudomonasputida中fprA對硫酸鹽同化具有調控作用[31]。伯克霍爾德氏菌Botkholderiaphytofirmans中PRF在硫酸鹽同化中發(fā)揮作用[32]。大腸桿菌中cysB對S-硫代半胱氨酸轉運子YdjN有調控作用；同時cysB也調控硫酸鹽同化過程[33]，不動桿菌中亦如此[16]。

4 重金屬脅迫下微生物硫酸鹽同化途徑的調控

4.1 微生物硫酸鹽同化途徑在重金屬抗性中的調控作用

金屬的二重性(微生物對金屬的代謝需求和金屬對微生物的潛在毒性)使得微生物發(fā)展出一系列金屬穩(wěn)態(tài)和抗性系統(tǒng)，以保持體內金屬離子微妙的平衡。

相較于傳統(tǒng)研究方法，例如測量生物群中的濃度和生化、生理和行為變化，組學方法可以提供對生物途徑和調節(jié)細胞命運、發(fā)育和進程的分子更深入的見解。近年來，隨著組學方法的傳播，特別是轉錄組和蛋白質組學方法的傳播，提供了研究微生物全基因組和蛋白質表達響應的可能性[8]。組學方法闡明了細胞過程，到目前為止，已有多篇組學相關文章指出硫酸鹽同化在重金屬抗性中具有重要作用。Rodrigo J. Alma?rcegui等人[34]通過定量蛋白組學分析40 mM CuSO4存在下，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌AcidithiobacillusferrooxidansATCC23270中的蛋白差異表達，結果表明CysN、CysD-2、CysJ、CysNC、CysI表達上調。Camila Salazar等人[35]對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌菌株A.ferrooxidansD2對325 mM銅脅迫的響應的微陣列研究中，結果表明cysD，cysI，cysN分別上調了4.39，2.61，3.36倍。Garrett H.等人[36]研究了金屬球菌Metallosphaerasedula對多種金屬(Co，Cu，Ni，Zn，U)的反應，發(fā)現(xiàn)4和8 mM銅刺激cysNHI基因顯著上調，而其他金屬刺激不上調。S.cerevisiae在鎘脅迫下，蛋白組分析表明，亞硫酸鹽還原酶(SiRB)亞基增加了2.5倍[37]。本實驗室對一株銅抗性菌的轉錄組測序研究表明，硫酸鹽同化途徑在銅脅迫下顯著性表達并上調，另外銅脅迫的菌株培養(yǎng)基中添加硫酸鹽有利于菌株抗性的增強。這些研究表明，硫酸鹽同化途徑在重金屬抗性中具有重要作用。

微生物硫酸鹽同化途徑在金屬脅迫下的調控作用的主要體現(xiàn)在硫酸鹽同化途徑的激活和抑制兩方面，如圖2。

(↑相關產物的增強；↓相關蛋白的減弱；┤抑制、清除) 圖2 微生物硫酸鹽同化途徑在重金屬抗性中的調控Fig.2 Regulation of microbial sulfate assimilation pathwray in heavy metal resistance

(1)激活作用

一些金屬可與還原態(tài)S2-形成硫化物。由于硫化物是生物學上不可利用的沉淀物，硫化物是金屬解毒態(tài)的優(yōu)選形式。沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris具有通過硫酸鹽同化途徑合成半胱氨酸的能力，在低濃度Pb2+、Cd2+存在時，半胱氨酸脫硫酶酶活性增強，可誘導半胱氨酸生成S2-，繼而形成PbS、CdS沉淀，然后排出體外[38]。在一些光合自養(yǎng)微生物亦有相似研究，如綠藻類，紅藻類，藍藻等在受到金屬脅迫時，均能夠在有氧條件下合成硫化物，形成ZnS[39]、CdS[40]和HgS[41]等。同時在這些生物中半胱氨酸脫硫酶活性亦有增強，向培養(yǎng)物中補充某一種硫源(硫酸鹽或亞硫酸鹽或半胱氨酸)時會促進菌體的生長與金屬硫化物沉淀的生成。這些研究表明微生物在受到金屬脅迫時會通過增多金屬硫化物沉淀的形成來達到解毒的目的，而半胱氨酸脫硫酶活性的增強說明形成金屬硫化物的硫來自于半胱氨酸，硫源的補充實驗說明，硫酸鹽同化途徑是半胱氨酸的主要來源。因而，微生物的硫酸鹽同化途徑在重金屬的抗性與解毒中可通過形成金屬硫化物沉淀的方式發(fā)揮作用。

為了限制游離金屬濃度，特定螯合劑的合成和金屬絡合物的隔離是非常重要的[42]。一般，金屬對硫醇(-SH)基團具有高親和力，生物體內常見硫醇物質有半胱氨酸、谷胱甘肽、金屬硫蛋白和植物螯合劑等。通常，半胱氨酸的巰基與幾乎所有金屬均能強烈結合，使游離半胱氨酸成為金屬離子的有效螯合劑。半胱氨酸的巰基可與Hg2+、Cu2+和Ag+等重金屬離子結合形成不溶性硫醇鹽[43]。一些蛋白中的半胱氨酸殘基也能與金屬結合，如已有研究表明FtsL在大腸桿菌E.coliK12細胞分裂中發(fā)揮結構作用，但FtsL蛋白的半胱氨酸殘基對于細胞分裂并不是必需的，卻影響菌株對Zn的抗性，推測缺乏半胱氨酸殘基的FtsL蛋白通過增加細胞質膜的滲透性導致菌株的Zn敏感性[44]。亦有研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸能有效絡合土壤中的Zn，且這種能力強于谷胱甘肽，但由于半胱氨酸的不穩(wěn)定性，這種絡合會隨時間衰減。另外，當半胱氨酸與具有氧化還原活性的金屬結合時，被迅速氧化，還原的金屬可能發(fā)生芬頓反應并形成有毒性作用的羥基自由基[42]。由于游離半胱氨酸可能是有毒的，轉化為肽使得它在細胞中保持低濃度。通過半胱氨酸與谷氨酸、甘氨酸的偶聯(lián)形成GSH的方式，細胞可以含有低濃度的半胱氨酸和相對高濃度的GSH，而不會引發(fā)有害的芬頓反應[45]。GSH是一種具有特殊生物學功能的由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，含有氨基、巰基、羧基和酰胺基等多種配位基團。一方面，GSH 是細胞內可以直接作用金屬離子的螯合劑，具有強烈親硫特征的金屬元素，如鎘，汞，鉛和砷，可以和GSH 分子中的巰基結合，從而達到解毒的作用。另一方面，GSH可以清除因重金屬脅迫產生的活性氧簇(ROS)[46]。

目前，金屬脅迫條件下關于硫酸鹽同化途徑的研究，主要是從硫化物生成、硫醇物質含量、相關酶活性和相關基因表達水平幾方面進行。A.ferrooxidans在Zn2+存在下，硫酸鹽同化途徑的基因(cysDEMH)與相應的酶表達均顯著性提高，胞內cys和GSH也翻倍增加；在高濃度Cd2+脅迫下，硫酸鹽同化途徑相關基因普遍顯著上調，cys和GSH隨Cd2+濃度和暴露時間上升，半胱氨酸合成酶活性隨Cd2+濃度呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢[47-48]。S.cerevisiae在Cd2+脅迫下，其硫轉運蛋白SULl、SUL2和ATP硫酸化酶(ATPS)、APS還原酶METl4(APSK)、PAPS還原酶METl6(PAPSR)的表達均有上調現(xiàn)象[49]。深色有隔真菌在Cd脅迫條件下，75%的硫酸鹽同化途徑的基因上調，表明其參與了Cd的抗性機制，推測這種上調有利于谷胱甘肽硫轉移酶與金屬硫蛋白的合成，以綁定胞內多余游離Cd[50]。在這些案例中，菌體受到重金屬脅迫后，硫酸鹽同化途徑相關酶的活性與基因表達均呈現(xiàn)增強與上調趨勢，這預示硫酸鹽同化途徑的增強，同時胞內半胱氨酸、谷胱甘肽的含量也增多，這表明半胱氨酸與谷胱甘肽通過胞內螯合參與重金屬抗性，同時谷胱甘肽還能清除由重金屬產生的ROS以解毒。

(2)抑制作用

另外，重金屬脅迫會抑制微生物的硫酸鹽同化途徑。A.caldus在高濃度的銅離子存在情況下，亞硫酸鹽氧化酶和APS還原酶的活性會呈現(xiàn)下調趨勢[51]。沙門腸桿菌Salmonellaenterica在160 μM 鈷脅迫下，亞硫酸鹽還原酶活性受到強烈抑制，鈷還與cysG中的Fe原子發(fā)生競爭抑制硫酸鹽同化途徑；菌體內GSH含量降低。另外谷胱甘肽合成基因gshA缺失菌株無法正常合成谷胱甘肽，對鈷的抗性降低[52]。這兩個案例中，由于金屬的脅迫，硫酸鹽同化途徑受到了抑制，這可能是由于這些金屬到對相關的硫酸鹽同化途徑的蛋白產生毒性。在最近的研究中，大腸桿菌在0.1 mM Ag脅迫下，硫酸鹽同化途徑活性(cysCDHI)降低，因而減少了半胱氨酸生物合成等過程所需的硫化氫的量，故Ag與硫化氫的相互作用幾率降低。蛋白CysH可與硫氧還蛋白相互作用，因此CysH的減少可以釋放還原態(tài)硫氧還蛋白，從而可能提高在Ag脅迫下產生的活性氧存在下的抗性。

不同微生物硫酸鹽同化途徑對重金屬脅迫有不同程度的響應，這可能與金屬毒性和菌種耐受性相關。但是，仍可以初步了解到硫酸鹽同化途徑確實在重金屬抗性中具有重要作用。

4.2 微生物硫酸鹽同化途徑調控在重金屬污染微生物修復中的潛在應用

微生物長期在重金屬存在的不良條件下會進化出一系列抗性機制來保證自身存活而不會對其生長和代謝產生影響。這些機制包括生物吸附、生物轉化、生物累積、胞外沉淀和外排作用等。這些抗性機制是應用微生物修復重金屬污染的基礎，同時具有這些獨特特征的微生物被證明是重金屬污染環(huán)境場所的生物修復的理想材料。近年來的研究表明，硫酸鹽同化也是微生物重金屬抗性機制的一部分，在微生物重金屬抗性中發(fā)揮作用。

目前，有關微生物硫酸鹽同化途徑在重金屬抗性中的調控作用已有很多報道，如A.ferrooxidans在多種重金屬脅迫下硫酸鹽同化途徑的不同調控模式。這表明微生物硫酸鹽同化途徑在重金屬污染的生物修復中具有應用潛力。Clifford L. Wang等人[53-54]通過構建突變體的方式，使得大腸桿菌的硫酸鹽同化途徑能過量產生半胱氨酸，并且過量的半胱氨酸可被半胱氨酸脫硫酶轉化為硫化物。這種大腸桿菌工程菌可在有氧條件下將鎘沉淀為硫化鎘沉積在細胞表面上，并且這種硫化鎘沉淀是在細胞壁表面形成的。這項研究是應用硫酸鹽同化途徑的遺傳工程菌以將重金屬沉淀為金屬硫化物的首次報道，但是相關的應用研究還不多?，F(xiàn)在通過構建基因工程菌的方式強化微生物硫酸鹽同化途徑應用于重金屬的生物修復這種途徑還不是一種即刻修復環(huán)境金屬污染的實用方法。如果基因工程途徑用于從污染環(huán)境中去除重金屬，可以考慮使用與環(huán)境更相關的生物。此外，還需要其他手段技術的應用以使這種基因工程生物在異質微生物環(huán)境中具有生長優(yōu)勢與競爭力。同時，硫化物具有結晶比較細小, 難以沉降的特點[55]，如何改善硫化物的沉降性能值得進一步研究[56]。

5 結論與展望

微生物硫酸鹽同化途徑是微生物獲得硫源的有效途徑，關于微生物硫酸鹽同化的研究主要集中在機理調控。而近年來組學的發(fā)展，使得其在微生物金屬抗性中的潛在作用得以挖掘。微生物在重金屬脅迫下硫酸鹽同化途徑呈現(xiàn)了不同的表達趨勢。已有一些研究針對微生物硫酸鹽同化途徑與重金屬抗性的相互關系進行了研究，但還不夠全面。因而，對于微生物硫酸鹽同化在重金屬脅迫條件下的深入研究一方面對于補充該微生物的金屬抗性機制具有重要意義，另一方面對更廣泛的應用遺傳工程菌在處理環(huán)境重金屬污染方面也具有指導意義。