黃坤，范小龍，曹琦，韓智，張莉，王會霞*，郭嘉

1(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢，430075)2(武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430205)

喹諾酮類獸藥是人工合成的廣譜性抗菌類抗生素，其吸收效果好、毒性較低，因而被廣泛應(yīng)用于畜禽動物的疾病防治[1-2]。但此類獸藥的濫用容易在動物體內(nèi)殘留蓄積，通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，形成對其耐藥性從而影響相關(guān)臨床療效[3]。歐盟、聯(lián)合國糧農(nóng)組織等均已指定多種喹諾酮類獸藥的最高殘留限量[4]，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第235號和2 292號公告也對喹諾酮類獸藥的使用做出了明確規(guī)定。目前動物性食品中喹諾酮類獸藥殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[5-8]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)[9-10]，但復(fù)雜基質(zhì)干擾使得液相色譜法的應(yīng)用受到限制，同時現(xiàn)行檢測方法還存在著前處理復(fù)雜、固相萃取耗時、回收率較低等問題。而QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)是一種快速、簡單、廉價、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于食品中的農(nóng)藥[11-13]獸藥的殘留檢測[14-16]，但是將該樣品前處理方法運(yùn)用于檢測禽蛋中喹諾酮類獸藥殘留的方法不多。針對以上問題，以市售生鴨蛋為例，本研究建立了一種QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定禽蛋中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星和沙拉沙星共7種喹諾酮類獸藥殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

XEVO TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；ME2002E和XS204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；RKTS-23050快速溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)，英國Genevac公司；QuEChERS凈化劑(含PSA、C18、無水Na2SO4的混合粉末，混合質(zhì)量比為1∶1∶60)，實(shí)驗(yàn)室自配。

恩諾沙星(enrofloxacin，純度99.9%)、鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin hydrochloride，純度94.0%)、氧氟沙星(ofloxacin，純度99.3%)、甲磺酸二水培氟沙星(pefloxacin mesylate dihydrate，純度99.0%)、諾氟沙星(norfloxacin，純度99.1%)、鹽酸洛美沙星(lomefloxacin hydrochloride，純度98.7%)、鹽酸沙拉沙星(sarafloxacin hydrochloride，純度91.2%)共7種標(biāo)準(zhǔn)品(均為固體)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈和甲酸(均為色譜純)，美國Thermo Fisher Scientific公司；NaCl(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水系統(tǒng)，Millipore公司；禽蛋，來自本實(shí)驗(yàn)室日常抽檢所用試驗(yàn)樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、氧氟沙星、甲磺酸二水培氟沙星、諾氟沙星、鹽酸洛美沙星和鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，必要時可加入少量甲酸超聲助溶。將以上各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈稀釋，配制成各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用初始流動相稀釋成4～200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取與試樣基質(zhì)相同的陰性樣品，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，同1.3項(xiàng)下處理，作為基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品溶液的制備

稱取已均質(zhì)的禽蛋試樣5 g于50 mL離心管中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的甲酸-乙腈和2 g NaCl，搖勻分散后渦旋提取2 min，以4 000 r/min離心2 min。 取全部上清液向其中加入QuEChERS凈化劑5 g，渦旋混勻2 min，以4 000 r/min離心2 min。上清液于45 ℃條件下快速溶劑蒸發(fā)至近干，加入初始比例流動相2.0 mL渦旋復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，濾液待分析。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

WatersAcquity UPLC超高效液相色譜儀；Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸，B相為乙腈；流速0.3 mL/min； 柱溫35 ℃；樣品池溫度10 ℃；進(jìn)樣量5 μL； 梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀選擇電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)，毛細(xì)管電壓為2.65 kV，脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設(shè)定為900和50 L/h，離子源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150和350 ℃。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下7種喹諾酮類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(60 ng/mL)的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 7種喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms(TIC) for the standard solution of 7 quinolones

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜參數(shù)的選擇

2.1.1 色譜參數(shù)的選擇

本研究分別考察了乙腈-0.1%三乙胺、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸(均為體積分?jǐn)?shù))作為流動相體系對喹諾酮類獸藥的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%三乙胺體系信號響應(yīng)較低，乙腈-水體系峰型拖尾，而乙腈-0.1%乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸2種體系峰型較好，綜合分離效果、響應(yīng)強(qiáng)度、測定時間以及系統(tǒng)穩(wěn)定性考慮，最終選擇非鹽體系：乙腈和0.1%的甲酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，使得喹諾酮類獸藥的峰型尖銳對稱、保留時間適宜。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

以10 μL/min的針泵流速注入200 ng/mL的7種喹諾酮類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，確定較為合適的母離子掃描條件，再對母離子進(jìn)行二級掃描，篩選信號最強(qiáng)的離子對作為定量離子，信號次強(qiáng)的離子對作為定性離子對，得到多反應(yīng)監(jiān)測條件(MRM)：定量及定性離子對、錐孔電壓和碰撞能量，詳見表2。

表2 7種喹諾酮類獸藥的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS conditions for 7 quinolones

注：*為定量子離子。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

大多數(shù)樣品中喹諾酮類獸藥殘留都是采用酸化或堿化的溶劑提取，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20366—2006《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[17]和GB/T 21312—2007《動物源性食品中14

種喹諾酮獸藥殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[18]分別采用了酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH=4.0)。有研究表明高比例乙腈的提取液會導(dǎo)致常規(guī)固相萃取柱的回收率較低，而EDTA-Mcllvaine緩沖液提取時由于溶液難以澄清而導(dǎo)致堵塞固相萃取柱，2種提取方式均存在不足[19]。本實(shí)驗(yàn)選擇無需過柱的QuEChERS粉末進(jìn)行凈化處理，分別考察了5%甲酸-乙腈、5%甲酸-水、100%乙腈(均為體積分?jǐn)?shù))作為提取液進(jìn)行均質(zhì)提取的回收率，結(jié)果表明沉淀蛋白方面5%甲酸-水效果欠佳，5%甲酸-乙腈與100%乙腈效果相當(dāng)，而5%甲酸-乙腈提取回收率高于100%乙腈。因此采用5%甲酸-乙腈作為提取液，保證較高回收率的同時可大幅度提高實(shí)驗(yàn)效率。

2.3 方法的線性范圍、檢出限和定量限

按照1.2處理得到質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、40、60、80、100 ng/mL的基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.4和2.1項(xiàng)下所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，以基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度X對定量離子的峰面積Y繪制各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明7種喹諾酮類獸藥濃度在2～100 ng/mL線性關(guān)系良好，R2均大于0.995，詳見表3。以信噪比S/N=3結(jié)合空白基質(zhì)噪音響應(yīng)確定方法的檢出限(LOD)為0.3 μg/kg， 以S/N=10確定方法的定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

表3 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear equations and coefficients

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為了驗(yàn)證本方法測定禽蛋中7種喹諾酮類獸藥殘留的可行性和準(zhǔn)確性，試驗(yàn)采用空白生鴨蛋基質(zhì)樣品(已檢測過的陰性樣品)進(jìn)行加標(biāo)回收率驗(yàn)證，加標(biāo)水平分別為2、5、10 μg/kg，按照1.3項(xiàng)下方法處理，每個水平重復(fù)6次試驗(yàn)，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表4。結(jié)果表明，平均回收率為77.20%～98.47%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～6.2%，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合實(shí)驗(yàn)室測定需求[20]。

表4 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviation

注：-為未檢出。

2.5 實(shí)際樣品的測定

按本研究所建立的方法，對實(shí)驗(yàn)室抽檢的一批80份產(chǎn)地各異的禽蛋樣品中喹諾酮類獸藥殘留進(jìn)行了檢測，結(jié)果測得其中1份雞蛋和1份鴨蛋樣品不合格，分別是恩諾沙星(以恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和計)82.1 μg/kg和氧氟沙星18.6 μg/kg，表明相關(guān)養(yǎng)殖行業(yè)存在喹諾酮類獸藥濫用的風(fēng)險，對該項(xiàng)目的風(fēng)險監(jiān)測與安全評估顯得極為重要。同時采用現(xiàn)行國標(biāo)方法GB/T 20366—2006和GB/T 21312—2007對不合格樣品進(jìn)行復(fù)測，測定結(jié)果與本方法完全一致。

3 結(jié)論

本研究建立了一種快速測定禽蛋中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星共7種喹諾酮類獸藥殘留的QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法有效解決了樣品處理過程中固相萃取柱堵塞與復(fù)雜基質(zhì)干擾等問題，與常規(guī)方法相比分析過程快速、簡單、回收率好、靈敏度高，滿足對禽蛋中喹諾酮類獸藥殘留測定的限量要求，能夠?yàn)榍莸凹跋嚓P(guān)農(nóng)產(chǎn)品的安全監(jiān)測及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。