崔美林，于有偉

(山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾，041004)

菱角(Trapaspp.)，又名烏菱、水栗等，系一年生蔓性水生草本，是我國(guó)傳統(tǒng)的食用蔬果，已有3 000多年的栽培歷史[1]。菱角果肉含有淀粉、蛋白質(zhì)、多種維生素及礦物質(zhì)，同時(shí)還富含黃酮、皂苷、多酚等活性物質(zhì)[2-4]，研究發(fā)現(xiàn)，菱角果肉具有“消渴、利尿、益精氣”、以及抗腫瘤、抗感染、降血糖等重要的藥理活性[5]。目前，菱角的食用與加工均以果肉為主，菱殼作為菱角果實(shí)的外種皮，常在加工中作為副產(chǎn)物被棄。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，菱殼中含有多糖、多酚、皂苷、生物堿等活性物質(zhì)[6-7]，具有抗氧化、抑菌、抑制腫瘤、保肝等功效[8-9]，具備潛在的研究及利用價(jià)值。

本文以菱角果肉與果殼作為研究對(duì)象，分別對(duì)其醇溶性提取物及水溶性提取物的主要成分進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)相應(yīng)的抗氧化能力進(jìn)行分析比較，旨在為菱角果殼、果肉的綜合利用奠定更充足的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菱角，市售。

標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁、沒(méi)食子酸、人參皂苷(純度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；大豆卵磷脂、TBA、Tris、BHA、香草醛、福林酚，北京索萊寶；葡萄糖、FeSO4、NaOH、苯酚、NaNO2、Al(NO3)3、高氯酸、FeCl3、鐵氰化鉀、冰乙酸、水楊酸、無(wú)水乙醇、三氯乙酸、焦性沒(méi)食子酸等(均為國(guó)產(chǎn)分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JA26038電子天平，上海精科天美儀器有限公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；DGX-90973B-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀儀器有限公司；高速多功能粉碎機(jī)，永康市展帆工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取液的制備

將菱角洗凈，果殼、果肉分離，分別于60 ℃干燥至恒重后研磨成粉末狀，過(guò)100目篩后于4 ℃冷藏備用。

分別稱取果殼、果肉樣品粉末3 g，以料液比1∶30 (g∶mL)加入甲醇，于40 ℃下超聲輔助提取20 min，離心取上清液定容至100 mL，即得果殼、果肉的醇溶性提取物。同時(shí)，分別稱取果殼、果肉樣品粉末3 g，以料液比1∶30(g∶mL)加入蒸餾水，于70 ℃下超聲輔助提取30 min，離心取上清液定容至100 mL，即得果殼、果肉的水溶性提取物。

1.3.2 活性成分含量的測(cè)定

分別取適量的菱角果殼、果肉醇溶性提取物樣品溶液，利用硝酸鋁顯色法測(cè)定其黃酮含量[10-11]，香草醛-高氯酸法測(cè)定皂苷含量[12-14]，福林酚法測(cè)定多酚含量[14]，并利用公式(1)分別計(jì)算各活性物質(zhì)含量。

分別取適量的菱角果殼、果肉水溶性提取物樣品溶液，利用苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量[15]，并利用公式(1)計(jì)算多糖含量。

(1)

式中：E，樣品中黃酮(或皂苷或多酚或水溶性多糖)的含量，mg/g；C，經(jīng)吸光度值計(jì)算得出的黃酮(或皂苷或多酚或水溶性多糖)質(zhì)量濃度，mg/mL；V1，測(cè)定體系的體積，mL；V，樣品提取液(醇溶性提取物或水溶性提取物溶液)總體積，mL；V2，測(cè)定時(shí)所取樣品提取液的體積，mL；W，樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

分別取適量的菱角果殼、果肉醇溶性提取物與水溶性提取物，測(cè)定DPPH自由基清除能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力、FRAP、以及還原力，并以BHA、抗壞血酸作為對(duì)照，綜合評(píng)價(jià)果殼、果肉醇溶性提取物與水溶性提取物的抗氧化能力。

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別量取不同體積果殼和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶劑補(bǔ)足至2 mL，DPPH清除能力測(cè)定參照BANGOUR等[16]方法，清除率計(jì)算方法如式(2)：

(2)

式中：Ai，2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液；Aj，2 mL無(wú)水乙醇溶液+2 mL樣品溶液；A0，2 mL DPPH溶液+2 mL無(wú)水乙醇溶液。

1.3.3.2 抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定

分別量取不同體積果殼和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶劑補(bǔ)足至1 mL，抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定參照李穎暢等[17]方法，抑制率計(jì)算方法如式(3)：

(3)

式中：AS，樣品添加各試劑處理后所測(cè)得的吸光值；AC，樣品溶劑代替樣品，添加各試劑處理后所測(cè)得的吸光值。

1.3.3.3 清除羥自由基能力的測(cè)定

分別量取不同體積果殼和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶劑補(bǔ)足至2 mL，清除羥自由基能力參照GAO等[18]方法，清除率計(jì)算方法如式(4)：

(4)

式中：Ai，樣品溶液添加各試劑處理后測(cè)得的吸光值；Aj，用水代替H2O2測(cè)得的吸光值；A0，用樣品溶劑代替樣品，添加各試劑處理后測(cè)得的吸光值。

1.3.3.4 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

分別量取不同體積果殼和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶劑補(bǔ)足至1 mL，清除超氧陰離子自由基能力參照寇娟妮等[19]方法，清除率計(jì)算方法如式(5)：

(5)

式中：△A，樣品溶液添加各試劑處理后在在325 nm波長(zhǎng)處每反應(yīng)30 s測(cè)一次吸光值，反應(yīng)5 min，所得到的斜率；△A0，以樣品溶劑代替樣品，測(cè)定鄰苯三酚的自氧化速率。

1.3.3.5 FRAP的測(cè)定

分別量取不同體積果殼和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶劑補(bǔ)足至1 mL，參照朱明明等[20]方法測(cè)定FRAP，根據(jù)吸光度的值，在FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求相應(yīng)的FeSO4摩爾數(shù)(μmol)，表征為FRAP值，F(xiàn)RAP值越強(qiáng)，表示抗氧化性越強(qiáng)。

1.3.3.6 還原力的測(cè)定

分別量取不同體積果殼和果肉的醇溶性和水溶性提取液，用溶劑補(bǔ)足至2 mL，鐵還原力測(cè)定參照鐵氰化鉀法[21]，以吸光值表征鐵還原能力，吸光值越高表明還原力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分的含量

分別提取菱角果殼與果肉中醇溶性物質(zhì)與水溶性物質(zhì)，并對(duì)其所含的主要活性成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菱角不同部位不同提取條件下活性成分的含量Fig.1 The content of active components in different parts of water chestnut in different extraction conditions

如圖1所示，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物和水溶性提取物中主要活性成分的含量有明顯差異，在對(duì)醇溶性提取物的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，果殼中皂苷、多酚、黃酮的含量分別為(31.18±2.33)、(189.52±5.31)、(56.12±2.98)mg/g，各含量均要顯著高于果肉，其中，果肉醇溶性提取物中各值分別為(8.57±0.92)、(33.11±1.95)、(3.05±1.45)mg/g。在對(duì)水溶性提取物的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，果殼與果肉中多糖含量分別為(139.72±4.22)、(123.43±2.85)mg/g。此外還可知，相同質(zhì)量菱角果殼的醇溶性提取物中的3種主要活性成分的含量梯度為多酚>黃酮>皂苷；而相同質(zhì)量菱角果肉的醇溶性提取物中的3種主要活性成分的含量梯度為多酚>皂苷>黃酮。結(jié)果證明，菱角果殼含有豐富的活性物質(zhì)，可為其進(jìn)一步回收利用、深入開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

2.2 菱角果殼、果肉的醇溶性與水溶性提取物抗氧化活性比較

在本試驗(yàn)的操作中，分別稱取果殼、果肉樣品粉末3 g，以料液比1∶30(g∶mL)加入甲醇(或蒸餾水)，超聲輔助提取后，離心取上清液定容至100 mL，即得果殼、果肉的醇溶性提取物(或水溶性提取物)。即可知,果殼醇溶性提取物中皂苷、多酚、黃酮的質(zhì)量濃度分別為(0.94±0.07)、(5.69±0.16)、(1.68±0.09)mg/mL；果殼水溶性提取物中多糖的質(zhì)量濃度為(4.19±0.13)mg/mL；而果肉醇溶性提取物中皂苷、多酚、黃酮的質(zhì)量濃度分別為(0.26±0.03)、(0.99±0.06)、(0.09±0.04)mg/mL；果肉水溶性提取物中多糖質(zhì)量濃度為(3.70±0.09)mg/mL。

現(xiàn)分別取菱角果殼、果肉醇溶性提取物、水溶性提取物0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL進(jìn)行各抗氧化能力指標(biāo)檢測(cè)。

2.2.1 DPPH自由基清除能力比較

由圖2可知，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物與水溶性提取物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且隨著底物添加量的增加呈上升趨勢(shì)。對(duì)于果殼醇溶性提取物而言，當(dāng)?shù)孜锾砑恿坑?.04 mL增至0.1 mL時(shí)，清除率從(70.87±1.15)%增至(99.01±1.46)%，并逐漸趨于穩(wěn)定。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜锾砑恿看笥?.2 mL時(shí)，4種提取物對(duì)DPPH清除率均可達(dá)到85%以上，表現(xiàn)出良好的清除能力。此外，綜合評(píng)價(jià)可知，清除能力的強(qiáng)弱基本體現(xiàn)為果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

圖2 提取物添加量對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of different addition of extracts on the free radical scavenging ability of DPPH

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力的比較

由圖3可知，菱角果殼、果肉的醇提物與水提物對(duì)超氧陰離子自由基均具有清除能力，且表現(xiàn)出梯度依賴性。對(duì)于果殼的醇溶性提取物與水溶性提取物而言，當(dāng)?shù)孜锾砑恿吭鲋?.8 mL時(shí)，清除率分別可達(dá)(97.46±2.23)%、(95.38±2.65)%。而且我們發(fā)現(xiàn)，果殼醇溶性提取物和果殼水溶性提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力明顯大于果肉。清除能力的強(qiáng)弱基本體現(xiàn)為：果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

圖3 提取物添加量對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of different addition of extracts on the scavenging ability of superoxide anion free-radical

2.2.3 抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的比較

由圖4可知，由亞鐵離子引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體系中，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物與水溶性提取物對(duì)脂質(zhì)的過(guò)氧化均具有明顯的抑制作用。對(duì)于果殼醇溶性提取物與水溶性提取物而言，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.2 mL時(shí)，抑制率分別為(76.06±1.69)%、(63.78±1.54)%，且隨著底物的增加抑制率趨于平緩，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.8 mL時(shí)，抑制率分別可達(dá)(85.34±0.94)%、(84.27±1.85)%。而且果殼醇溶性提取物和果殼水溶性提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力明顯大于果肉?？怪|(zhì)過(guò)氧化能力的強(qiáng)弱基本體現(xiàn)為果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

圖4 添加不同提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化能力的影響Fig.4 Effect of different addition of extracts on on lipid peroxidation ability

2.2.4 FRAP的比較

由圖5可知，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物與水溶性提取物對(duì)亞鐵離子均具有還原能力。對(duì)于果殼醇溶性提取物與水溶性提取物而言，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.1 mL時(shí)，F(xiàn)RAP值分別為(0.503±0.017)、(0.472±0.014)，且隨著底物的增加,抑制率趨于平緩，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.8 mL時(shí)，F(xiàn)RAP值分別為(0.516±0.015)、(0.518±0.021)。FRAP強(qiáng)弱基本體現(xiàn)為：果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

圖5 添加不同提取物的亞鐵還原能力Fig.5 The ferrous reduction ability of different addition of extracts

2.2.5 羥自由基清除能力的比較

由圖6可知，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物與水溶性提取物對(duì)羥自由基均有一定的清除能力，且呈現(xiàn)劑量依賴性。對(duì)于果殼醇溶性提取物與水溶性提取物而言，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.8 mL時(shí)，清除率分別可達(dá)(31.12±1.29)%、(27.71±1.66)%；并且，果殼醇溶性提取物和果殼水溶性提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力明顯大于果肉。清除能力的強(qiáng)弱基本體現(xiàn)為,果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

圖6 添加不同提取物對(duì)羥基自由基清除能力的影響Fig.6 Effect of different addition of extracts on the scavenging ability of hydroxyl radical

2.2.6 還原力的比較

電子的轉(zhuǎn)移與抗氧化劑的還原力有密切關(guān)系，良好的電子供體會(huì)使鐵離子還原為亞鐵離子，溶液的顏色發(fā)生改變，可通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)判斷還原的程度，反應(yīng)后吸光度越大，表示還原能力越強(qiáng)。由圖7可知，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物與水溶性提取物的還原力隨底物添加量的增加而增強(qiáng)。對(duì)于果殼醇溶性提取物與水溶性提取物而言，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?.2 mL時(shí)，吸光值分別為(2.67±0.13)、(2.66±0.19)，且隨著底物的增加,吸光值趨于平緩。并且，果殼醇溶性提取物和果殼水溶性提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力明顯大于果肉。還原力的強(qiáng)弱基本體現(xiàn)為果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果可知，菱角果殼、果肉的醇溶性提取物和水溶性提取物的抗氧化能力呈現(xiàn)明顯差異。主要原因在于：果殼醇溶性提取物中黃酮、多酚、皂苷含量要明顯高于果肉，同樣，果殼水溶性提取物中的多糖含量也要明顯高于果肉，同時(shí)，林秋生在研究中也指出，對(duì)于菱角果殼而言，甲醇提取物的活性要明顯高于水提取物[5]；此外，菱角果殼中還含有具有抗氧化性的生物堿和甾醇類化合物[22-23]。

圖7 添加不同提取物的提取液的還原力Fig.7 The reduction ability of of different addition of extracts

綜上所述，菱角醇溶性提取物的抗氧化性要強(qiáng)于水溶性提取物，果殼提取物的抗氧化性也要明顯強(qiáng)于果肉，整體表現(xiàn)為果殼醇溶性提取物>果殼水溶性提取物>果肉醇溶性提取物>果肉水溶性提取物。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)比較果殼、果肉中主要的醇溶性物質(zhì)與水溶性物質(zhì)，得知果殼醇溶性提取物中皂苷、多酚、黃酮的含量均要顯著高于果肉，果殼水溶性提取物中多糖含量也要高于果肉。繼而對(duì)果殼、果肉中醇溶性提取物與水溶性提取物的抗氧化能力進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，各條件下的提取物對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)羥自由基也具備一定的清除能力，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化有較高的抑制作用，同時(shí)還具有較強(qiáng)的還原力和亞鐵還原能力，表明菱角果殼、果肉具備良好的抗氧化能力。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，菱角果殼提取物的抗氧化性明顯強(qiáng)于果肉，且醇溶性提取物較水溶性提取物的抗氧化性更強(qiáng)。該研究可為菱角的深入加工，尤其是菱殼回收再利用——“變廢為寶”提供重要的理論依據(jù)。