李鵬程 畢真真 梁文君 孫 超 張俊蓮 白江平,*

DNA甲基化參與調(diào)控馬鈴薯干旱脅迫響應(yīng)

李鵬程1,2,**畢真真1,2,**梁文君1,2孫 超1,2張俊蓮1白江平1,2,*

1甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅蘭州 730070;2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070

非生物脅迫下表觀遺傳對(duì)調(diào)控植物基因表達(dá)起重要作用, 但是有關(guān)馬鈴薯干旱脅迫下的表觀遺傳研究甚少。本研究以馬鈴薯品種大西洋、費(fèi)烏瑞它、C119、C16和青薯9號(hào)為試驗(yàn)材料, 以MS培養(yǎng)基為對(duì)照以及分別添加200 mmol L-1甘露醇、60 μmol L-1甲基化抑制劑(5-azadC)和60 μmol L-1甲基化抑制劑+200 mmol L-1甘露醇, 處理24 d后對(duì)試管苗表型性狀和生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 不同品種馬鈴薯對(duì)甘露醇和甲基化抑制劑響應(yīng)程度趨勢(shì)類(lèi)似。在干旱和DNA甲基化抑制劑分別處理下, 馬鈴薯植株干鮮重、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量均顯著減少(<0.05), SOD、POD、CAT活性和Pro、MDA含量均顯著增加(<0.05), 而分枝數(shù)、根長(zhǎng)、平均根粗均無(wú)明顯變化, 表明馬鈴薯不同性狀指標(biāo)在響應(yīng)干旱脅迫和DNA去甲基化時(shí), 受到的調(diào)控通路可能不同。進(jìn)一步比較干旱脅迫和DNA去甲基化共同處理與分別處理下表型性狀和生理指標(biāo)的差異發(fā)現(xiàn), 共同處理使馬鈴薯植株表型性狀受到進(jìn)一步抑制, 同時(shí)活化了SOD、POD、CAT, 并且使Pro、MDA含量增加, 表明馬鈴薯在響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中, 部分表型的形成與DNA甲基化調(diào)控相關(guān)。這將為深入研究馬鈴薯干旱脅迫響應(yīng)與表觀遺傳學(xué)之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路提供初步的理論基礎(chǔ)。

馬鈴薯; 干旱脅迫; DNA甲基化; 形態(tài)生理; 綜合評(píng)價(jià)

馬鈴薯(L.)是茄科一年生草本塊莖植物, 其栽培范圍遍布全球。中國(guó)的馬鈴薯種植區(qū)域主要分布在西北干旱和半干旱地區(qū), 總產(chǎn)量位居全國(guó)第一, 現(xiàn)已發(fā)展成為這些地區(qū)的重要支柱產(chǎn)業(yè)[1], 但是其單產(chǎn)卻低于全國(guó)平均水平[2], 主要是因?yàn)轳R鈴薯在塊莖形成及膨大期間的水分缺失嚴(yán)重影響了馬鈴薯植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育[3]。因此, 可通過(guò)提高馬鈴薯對(duì)水分缺失的耐受性, 進(jìn)而提高馬鈴薯的產(chǎn)量。

對(duì)表觀遺傳機(jī)理的解析可以作為作物抗逆遺傳改良的重要途徑之一[4-5]。植物中的DNA甲基化分布具有物種、組織、器官、位點(diǎn)特異性和時(shí)空特異性[6-7], 在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的調(diào)控作用[8]。非生物脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)DNA甲基化水平的改變, 激活脅迫相關(guān)基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)座子的活性以及調(diào)控啟動(dòng)子區(qū)域的開(kāi)關(guān), 以增強(qiáng)植物適應(yīng)及抵御脅迫的能力[9]。潘雅姣等[10]發(fā)現(xiàn), 水稻在干旱脅迫處理下, 降低其葉和根的甲基化程度有利于激活基因的表達(dá), 從而提高水稻耐旱性。研究DNA甲基化常用的方法是通過(guò)高分辨率的參考基因組裝配和亞硫酸氫鹽測(cè)序繪制基因組中現(xiàn)有的甲基化模式。這種方法富有成效, 但它是描述性的, 而不是試驗(yàn)性的。另一種方法是通過(guò)試驗(yàn)來(lái)改變其甲基化水平[11], 植物中常用5-Aza-2’-脫氧胞苷(5-azadC)來(lái)抑制其甲基化程度。5-azadC是胞嘧啶的類(lèi)似物,不可逆地與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合, 使基因組難以維持甲基化狀態(tài), 從而引起DNA的去甲基化[12]。毛銳濤[13]用DNA甲基化抑制劑處理馬鈴薯品種大西洋試管苗, 發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化處理嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育。在小麥中, 5-氮雜胞苷通過(guò)降低小麥基因組DNA甲基化水平來(lái)提高耐鹽性[14]。以上研究表明甲基化變異在抗旱研究中存在潛在的應(yīng)用價(jià)值, 可通過(guò)發(fā)掘與作物抗旱相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控相關(guān)基因, 對(duì)作物的抗旱性進(jìn)行遺傳改良。

目前, 相對(duì)于模式植物擬南芥以及水稻、小麥、玉米等主要農(nóng)作物, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者有關(guān)馬鈴薯DNA甲基化的研究主要集中在離體培養(yǎng)及脅迫環(huán)境下DNA甲基化的變化方面[15-18]。但有關(guān)DNA甲基化在調(diào)控馬鈴薯響應(yīng)干旱脅迫下生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化的研究卻少見(jiàn)報(bào)道。本研究主要通過(guò)甲基化抑制劑處理不同干旱敏感的馬鈴薯品種, 并比較在干旱脅迫下去甲基化對(duì)馬鈴薯試管苗表型性狀及生理生化的響應(yīng), 為進(jìn)一步解析馬鈴薯干旱脅迫響應(yīng)的表觀遺傳學(xué)機(jī)理提供初步的表型基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)思路, 為開(kāi)辟研究馬鈴薯抗旱分子育種的新方法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大西洋(Atl)和費(fèi)烏瑞它(Fav)為干旱敏感型品種; C119 (CIP編號(hào)為398098.119)為抗旱中間型材料; C16 (CIP編號(hào)為397077.16)和青薯9號(hào)(QS9)為抗旱品種。其中C16和C119引自國(guó)際馬鈴薯中心(CIP), 其余由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。5-azadC (5-aza-2’-deoxycytidine)購(gòu)于Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別將5個(gè)品種的馬鈴薯試管苗莖段接種于4種不同的培養(yǎng)基上。即正常的MS培養(yǎng)基(對(duì)照, T0)、含200 mmol L-1甘露醇的MS培養(yǎng)基(干旱處理, T1)、含60 μmol L-15-azadC的MS培養(yǎng)基(去甲基化處理, T2)、含60 μmol L-15-azadC與200 mmol L-1甘露醇的MS培養(yǎng)基(去甲基化與干旱共同處理, T3)。培養(yǎng)條件為溫度(22±2)℃, 光強(qiáng)25.0~37.5 μmol m-2s-1, 光照16 h d-1。處理24 d后, 從每個(gè)處理隨機(jī)挑選10株較為一致的試管苗分析形態(tài)指標(biāo), 同時(shí)取3份樣品供生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 (1)形態(tài)指標(biāo)測(cè)定。株高、葉片數(shù)和分枝數(shù)直接觀察測(cè)量, 使用根系掃描儀(EPSON Scan 2 12000XL 2.2)和根系形態(tài)與結(jié)構(gòu)分析儀(WinRHIZO 2017a)測(cè)定馬鈴薯試管苗總根長(zhǎng)和平均根粗等主要根系參數(shù)。使用佳能單反相機(jī)(Canon EOS 5D Mark II)進(jìn)行植株形態(tài)拍照(圖1)。(2)植株干鮮重測(cè)定。將試管苗用無(wú)菌水清洗, 吸去表面的水分, 稱(chēng)量鮮重; 然后將植株放入錫箔紙中于105℃殺青40 min, 85℃烘直至恒重, 稱(chēng)量干重。(3)生理生化指標(biāo)測(cè)定。葉綠素含量采用80%丙酮浸泡法[19], 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光還原法[20], 過(guò)氧化物歧化酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[20], 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法[20], 丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[20], 游離脯氨酸(Pro)含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法[20]。所有生理生化指標(biāo)均3次重復(fù), 取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Genstat 19.0進(jìn)行方差分析、主成分分析和聚類(lèi)分析; GraphPad Prism 7.0數(shù)據(jù)作圖, 利用隸屬函數(shù)對(duì)5個(gè)馬鈴薯品種分別進(jìn)行干旱及去甲基化響應(yīng)性綜合評(píng)價(jià)。

不同處理下的所有性狀數(shù)據(jù)均采用相對(duì)值。

= 1, 2, 3, …,(3)

A~E分別為大西洋、費(fèi)烏瑞它、C119、C16和青薯9號(hào)處理24 d后結(jié)果。T0: CK; T1: 5-azadC; T2: 甘露醇; T3: 5-azadC+甘露醇。每個(gè)處理選取3株用于照相。標(biāo)尺為2 cm。

A–E are the phenotype of Atl, FAV, C119, C16, and QS9 after 24 days of treatment. T0: CK; T1: 5-azadC; T2: mannitol; T3: 5-azadC+mannitol. Three plantlets of each treatment were selected for photography. Bar = 2 cm.

式(4)中,(X)指第個(gè)綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,X指第個(gè)綜合指標(biāo)值,max指第個(gè)綜合指標(biāo)的最大值,min指第個(gè)綜合指標(biāo)的最小值。

各綜合指標(biāo)權(quán)重的計(jì)算:

式(5)中,W表示第個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度及權(quán)重;P為各品種第個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

綜合評(píng)價(jià)值的計(jì)算:

式(6)中,表示不同馬鈴薯品種抗旱性和對(duì)5-azadC的響應(yīng)性的綜合評(píng)價(jià)值。通過(guò)計(jì)算加權(quán)隸屬函數(shù)值所得值。值越大表明抗旱性越強(qiáng)以及對(duì)5-azadC的響應(yīng)性越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1 表型性狀和生理生化指標(biāo)分析 馬鈴薯試管苗在甘露醇模擬干旱脅迫下各表型性狀(圖1)和生理生化特性(圖2)均存在差異, 一般利用相對(duì)值來(lái)反映不同品種的抗旱性。各個(gè)性狀抗旱系數(shù)由高到低依次為丙二醛、過(guò)氧化氫酶、游離脯氨酸、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、平均根粗、葉綠素、總根長(zhǎng)、葉片數(shù)、干重、分枝數(shù)、株高、鮮重, 變化范圍在0.4175~2.3830 (表1)。表明參試馬鈴薯品種不同性狀的抗旱性存在明顯差異。各品種對(duì)干旱的綜合響應(yīng)系數(shù)CRC值介于0.9515~1.3897, 馬鈴薯品種的抗旱性由強(qiáng)到弱依次為青薯9號(hào)>C16>費(fèi)烏瑞它>C119>大西洋。

2.1.2 主成分分析 由表2和表3可知, 與抗旱性相關(guān)的前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為98.26%, 其中PC1的特征值是8.595, 貢獻(xiàn)率為66.12%, 其較大的特征向量是分枝數(shù)和葉片數(shù); PC2的特征值是2.46, 貢獻(xiàn)率為18.92%, 載荷較高的是株高和游離脯氨酸; PC3的特征值是1.719, 貢獻(xiàn)率為13.22%, 載荷較高的是丙二醛。這樣可以分別把抗旱系數(shù)的13個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo), 同時(shí)也可以代表原始數(shù)據(jù)的大部分信息。

2.1.3 綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)對(duì)抗旱性的主成分分析分別得到的3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo), 利用公式(4)計(jì)算不同品種各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值(X)。從表4可以看出, 干旱脅迫處理下, 同一綜合指標(biāo)CI(1)中, 青薯9號(hào)(1)最大, 為1.0000, 表明青薯9號(hào)在CI(1)綜合指標(biāo)上的抗旱性最強(qiáng)。根據(jù)各綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率, 利用公式(5)計(jì)算其權(quán)重W, 計(jì)算得到與抗旱性相關(guān)的3個(gè)綜合指標(biāo)權(quán)重分別為0.6729、0.1926、0.1345。進(jìn)一步利用公式(6)計(jì)算抗旱性的綜合評(píng)價(jià)值, 根據(jù)值, 抗旱性為青薯9號(hào)>C16> C119>大西洋>費(fèi)烏瑞它。

圖2 不同處理下馬鈴薯試管苗表型和生理生化指標(biāo)的變化

顯著性分析使用Duncan’s法進(jìn)行多重比較(< 0.05)。Multiple comparisons were performed with Duncan’s method (< 0.05).

表1 不同品種馬鈴薯各指標(biāo)對(duì)甘露醇和5-azadC分別處理的響應(yīng)程度

(續(xù)表1)

FW: fresh weight; DW: dry weight; SH: shoot height; NB: number of branches; NL: number of leaves; RL: root length; ARD: average root diameter; SOD: superoxide dismutase; POD: peroxidase; CAT: catalase; Pro: proline; MDA: malonaldehyde; Chl: chlorophyll; CRC: comprehensive response coefficient.

表2 各綜合指標(biāo)特征值及貢獻(xiàn)率

表3 各表型因子載荷矩陣

縮寫(xiě)同表1。Abbreviations are the same as those given in Table 1.

表4 供試品種的綜合性狀指標(biāo)、權(quán)重、μ(X)及綜合評(píng)價(jià)值(D)

2.2 DNA甲基化抑制劑對(duì)馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 表型性狀和生理生化指標(biāo)分析 馬鈴薯試管苗在5-azadC處理下各表型性狀(圖1)和生理生化特性(圖2)也存在明顯差異, 由表1可知, 各個(gè)考察性狀對(duì)5-azadC響應(yīng)系數(shù)的變化范圍為0.9902~1.0797, 由高到低依次為丙二醛、超氧化物歧化酶、分枝數(shù)、干重、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、株高、平均根粗、鮮重、葉綠素、葉片數(shù)、游離脯氨酸、總根長(zhǎng)。利用公式(3)計(jì)算各品種對(duì)5-azadC綜合響應(yīng)系數(shù)的CRC值介于0.8753~1.1114。根據(jù)5-azadC綜合響應(yīng)系數(shù)對(duì)供試馬鈴薯進(jìn)行排序, 響應(yīng)程度為青薯9號(hào)>C16>費(fèi)烏瑞它>大西洋>C119。

2.2.2 主成分分析 由表2和表3可知, 與5-azadC響應(yīng)性相關(guān)的前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.01%, 其中PC1的特征值是6.750, 貢獻(xiàn)率為51.92%, 對(duì)應(yīng)較大的特征向量是SOD、POD、CAT、Pro; PC2的特征值是2.757, 貢獻(xiàn)率為21.20%, 載荷較高的是平均根粗; PC3的特征值是2.456, 貢獻(xiàn)率為18.89%, 載荷較高的是總根長(zhǎng)、葉片數(shù)、Chl和株高。這樣可以把對(duì)5-azadC響應(yīng)系數(shù)的13個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo), 同時(shí)也可以代表原始數(shù)據(jù)的大部分信息。

2.2.3 綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)對(duì)5-azadC響應(yīng)性的主成分分析分別得到的3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo), 利用公式(4)計(jì)算不同品種各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值(X)。從表4可以看出, 同一綜合指標(biāo)CI(1)中, 青薯9號(hào)(1)最大, 為1.0000。表明青薯9號(hào)在CI(1)綜合指標(biāo)上對(duì)5-azadC的響應(yīng)最弱。根據(jù)各綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率, 利用公式(5)計(jì)算其權(quán)重W, 計(jì)算得到與對(duì)5-azadC的響應(yīng)性相關(guān)的3個(gè)綜合指標(biāo)權(quán)重分別為0.5643、0.2304、0.2053。進(jìn)一步利用公式(6)計(jì)算對(duì)5-azadC的響應(yīng)性的綜合評(píng)價(jià)值, 并根據(jù)值對(duì)5-azadC的響應(yīng)性為青薯9號(hào)>C16>C119>費(fèi)烏瑞它>大西洋。

2.3 干旱脅迫及DNA甲基化抑制劑對(duì)馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)影響的差異比較

從圖2可以看出, 干旱和DNA去甲基化處理下, 不同基因型馬鈴薯試管苗的干鮮重、株高和總根長(zhǎng)顯著減少(<0.05), 而青薯9號(hào)和費(fèi)烏瑞它的分枝數(shù)無(wú)顯著變化。C16分枝數(shù)在去甲基化處理下無(wú)顯著變化, 而干旱處理下顯著減少(<0.05)。青薯9號(hào)葉片數(shù)在干旱處理下無(wú)顯著變化, 而去甲基化處理下顯著減少(<0.05)。平均根粗除C16在干旱處理下顯著減少(<0.05)外, 其余均無(wú)顯著變化。SOD、POD在干旱脅迫下均顯著增加(<0.05), 除C119 SOD無(wú)明顯變化外, 而去甲基化處理下青薯9號(hào)顯著增加(<0.05), 其余均無(wú)差異。CAT在干旱處理下均顯著增加(<0.05), 而去甲基化處理下大西洋、C119和C16無(wú)顯著變化, 費(fèi)烏瑞它和青薯9號(hào)顯著增加(<0.05)。Pro在干旱處理下均顯著增加(<0.05), 而去甲基化處理下除大西洋和費(fèi)烏瑞它無(wú)顯著變化外, 其余均顯著增加(<0.05)。MDA在干旱處理下均顯著增加(<0.05), 而去甲基化處理下均無(wú)顯著變化。大西洋、費(fèi)烏瑞它、C16和青薯9號(hào)的葉綠素含量在去甲基化處理下顯著增加(<0.05), 而干旱處理下大西洋和費(fèi)烏瑞它顯著減少(<0.05), C16和青薯9號(hào)無(wú)差異。C119在2種處理下的葉綠素含量均顯著減少(<0.05)。

從表5可以看出, 干旱處理與5-azadC處理相比, 使馬鈴薯植株干鮮重、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量均顯著減少(<0.05), 其中葉片數(shù)和葉綠素含量減少幅度最大, 分別為33.35%和37.00%; SOD、POD、CAT活性和Pro、MDA含量均顯著增加(<0.05), MDA含量增加幅度最大, 為121.01%; 而分枝數(shù)、根長(zhǎng)、平均根粗均無(wú)明顯變化。

2.4 干旱脅迫及DNA甲基化抑制劑共同處理對(duì)馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)的影響

以上結(jié)果表明, 甲基化抑制劑對(duì)馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)的影響與干旱脅迫的影響非常相似, 為了進(jìn)一步分析DNA去甲基化與馬鈴薯響應(yīng)干旱脅迫響應(yīng)的關(guān)系, 比較了5-azadC和甘露醇共同處理與分別單獨(dú)處理24 d后各馬鈴薯植株形態(tài)和生理生化指標(biāo)。從圖2可以看出, 與5-azadC和甘露醇單獨(dú)處理相比, 共同處理下, 除QS9的干鮮重和株高外, 其余馬鈴薯試管苗的表型性狀均呈下降趨勢(shì)(圖1); 而5種基因型馬鈴薯品種的SOD、POD、CAT活性、Pro和MDA含量呈增加趨勢(shì), 其中響應(yīng)5-azadC和甘露醇越強(qiáng)的品種(如大西洋、費(fèi)烏瑞它), 其SOD、POD、CAT活性以及Pro含量增加幅度越大, 而MDA含量則反之。

通過(guò)二因素方差分析對(duì)干旱處理/對(duì)照處理(T1/T0)、5-azadC處理/對(duì)照處理(T2/T0)、共同處理/對(duì)照處理(T3/T0)之間的差異性進(jìn)行分析, 由表5可知, 與5-azadC處理相比, 5-azadC和甘露醇共同處理下, 馬鈴薯試管苗干鮮重、株高、葉片數(shù)、分枝數(shù)、總根長(zhǎng)和葉綠素含量均顯著減少(<0.05), 其中分枝數(shù)和葉片數(shù)減少幅度最大, 分別為51.37%和52.41%; SOD、POD、CAT活性和Pro、MDA含量均顯著增加(<0.05), MDA含量增加幅度最大, 為139.82%, 而平均根粗則無(wú)明顯變化。與甘露醇處理相比, 兩者共同處理下馬鈴薯試管苗的干鮮重、株高、葉片數(shù)和總根長(zhǎng)均顯著減少(<0.05), 其葉片數(shù)減少幅度最大, 為28.39%, SOD、POD活性和葉綠素含量均顯著增加(<0.05), 其中葉綠素含量增加幅度最大, 為46.54%, 而分枝數(shù)、平均根粗、CAT活性和Pro含量無(wú)明顯變化。

表5 甘露醇和5-azadC單獨(dú)與共同處理下馬鈴薯試管苗各指標(biāo)比較分析

顯著性分析使用Duncan’s法進(jìn)行多重比較(< 0.05)。縮寫(xiě)同表1。

The significance analysis was performed by multiple comparisons using the Duncan’s method (< 0.05). Abbreviations are the same as those given in Table 1.

3 討論

干旱是影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)最重要的非生物因素。在長(zhǎng)期進(jìn)化中, 植物形成了系統(tǒng)的抗旱機(jī)制[21]。一些研究發(fā)現(xiàn), 植物通過(guò)基因組DNA的甲基化、去甲基化過(guò)程快速地應(yīng)對(duì)外界干旱環(huán)境, 表明DNA甲基化在植物響應(yīng)干旱脅迫中起重要作用[22]。而目前有關(guān)馬鈴薯抗旱性與DNA甲基化之間的研究較少。本研究利用DNA甲基化抑制劑、甘露醇模擬干旱脅迫分別處理不同品種馬鈴薯試管苗, 分析對(duì)其形態(tài)和生理生化的影響, 來(lái)初步預(yù)測(cè)DNA甲基化與馬鈴薯響應(yīng)干旱脅迫之間的關(guān)系。

植物暴露于外源5-azadC, 可通過(guò)限制DNA甲基化來(lái)誘導(dǎo)表型和發(fā)育性狀變異。許多植物已經(jīng)顯示出這種現(xiàn)象, 例如造成水稻株高降低以及馬鈴薯花和葉片形態(tài)的異常發(fā)育[23-24]。研究發(fā)現(xiàn), 去甲基化處理顯著抑制了馬鈴薯的生長(zhǎng)和發(fā)育。植物對(duì)不同處理的響應(yīng)程度往往受多種因素影響。為了減少不同品種間各自的遺傳背景差異, 使評(píng)價(jià)更具有代表性, 往往用多種相關(guān)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)及分析[25-27]。本試驗(yàn)分別選取了馬鈴薯在5-azadC、甘露醇處理下的13個(gè)指標(biāo)用于綜合評(píng)價(jià)。通過(guò)主成分分析可將13個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成3個(gè)新的相對(duì)獨(dú)立的綜合指標(biāo), 進(jìn)一步對(duì)3個(gè)新的綜合指標(biāo)利用隸屬函數(shù)分析法得到響應(yīng)5-azadC和干旱的綜合評(píng)價(jià)值。根據(jù)綜合評(píng)價(jià)值, 5種馬鈴薯品種對(duì)干旱和DNA甲基化抑制劑響應(yīng)程度趨勢(shì)類(lèi)似。同時(shí), 對(duì)干旱脅迫及DNA甲基化抑制劑差異比較發(fā)現(xiàn), 馬鈴薯植株干鮮重、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量均顯著減少(<0.05); SOD、POD、CAT活性和Pro、MDA含量均顯著增加(<0.05), 而分枝數(shù)、根長(zhǎng)、平均根粗均無(wú)明顯變化。這說(shuō)明馬鈴薯不同指標(biāo)對(duì)響應(yīng)干旱脅迫和DNA甲基化抑制的調(diào)控通路可能有所差異。

為了進(jìn)一步研究DNA甲基化與馬鈴薯響應(yīng)干旱脅迫之間的關(guān)系。本研究比較了5-azadC和甘露醇共同處理與分別處理下, 不同馬鈴薯植株的表型性狀和生理特性差異, 發(fā)現(xiàn)雖然不同馬鈴薯品種響應(yīng)5-azadC和甘露醇的強(qiáng)弱不同, 但是共同處理使其表型性狀均受到抑制, 同時(shí)活化了SOD、POD、CAT活性, 增加了Pro、MDA的含量。通過(guò)二因素方差分析消除品種間差異, 比較不同處理下的表型和生理生化指標(biāo)差異。與5-azadC、甘露醇單獨(dú)處理相比, 二者共同處理下馬鈴薯植株干鮮重、株高、葉片數(shù)、總根長(zhǎng)均顯著降低, 而SOD、POD活性均顯著升高, 說(shuō)明干旱脅迫與去甲基化可能相互作用, 通過(guò)不同調(diào)控途徑最終來(lái)影響植株的這些表型性狀和生理指標(biāo); 而平均根粗無(wú)明顯變化, 說(shuō)明干旱脅迫與去甲基化可能通過(guò)相同的途徑調(diào)控這些性狀。在研究5-azaC對(duì)苜蓿耐鹽性中發(fā)現(xiàn), 5-azaC可能對(duì)植物生長(zhǎng)有一些副作用, 導(dǎo)致生長(zhǎng)明顯受到抑制, 表現(xiàn)為幼苗株高和干重減少。這表明DNA甲基化對(duì)苜蓿的耐鹽性是必要的, 并且與MSAP (methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)的結(jié)果相一致[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化顯著抑制馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育。雖然去甲基化影響植物的表型生長(zhǎng), 但植物卻可以同時(shí)通過(guò)DNA去甲基化來(lái)調(diào)控體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)、外源基因的防御及基因表達(dá)模式的改變等過(guò)程, 參與植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng), 從而使植物更加快速地應(yīng)對(duì)外界干旱環(huán)境[29]。鐘蘭[30]在研究發(fā)現(xiàn), 5-氮雜胞可通過(guò)參與活化小麥體內(nèi)響應(yīng)逆境脅迫的抗氧化酶系統(tǒng), 來(lái)顯著緩解鹽脅迫對(duì)小麥生長(zhǎng)所造成的抑制作用。本研究結(jié)果也說(shuō)明, 5-azadC可能通過(guò)DNA去甲基化參與馬鈴薯對(duì)干旱脅迫的響應(yīng), 提高馬鈴薯SOD、POD的活性, 最終顯著增強(qiáng)馬鈴薯體內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶系統(tǒng)活性, 來(lái)緩解干旱脅迫對(duì)馬鈴薯植株造成的影響。

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DNA methylation involved in regulating drought stress response of potato

LI Peng-Cheng1,2,**, BI Zhen-Zhen1,2,**, LIANG Wen-Jun1,2, SUN Chao1,2, ZHANG Jun-Lian1, and BAI Jiang-Ping1,2,*

1Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science / Gansu Key Lab of Crop Improvement & Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, Gansu, China;2College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

Although epigenetics is essential for regulating gene expression in plant under abiotic stress, there are few reports regarding the epigenetics of potato under drought stress. In this study, five potato cultivars including Atlantic, Favorita, C119, C16, and Qingshu 9, were used to verify that DNA methylation is involved in potato drought stress response. The plantlets were cultured for 24 days on MS medium, MS medium supplemented with 60 μmol L-1methylation inhibitor (5-azadC), 200 mmol L-1mannitol, and 60 μmol L-1methylation inhibitor combined with 200 mmol L-1mannitol, respectively. Phenotypes, and physiological and biochemical traits were recorded and comprehensively analyzed. The response of five potato cultivars to mannitol and 5-azadC was similar.With treatments of mannitol or 5-azadC, the dry/fresh weight, shoot height, leaf number and chlorophyll content decreased significantly (< 0.05), while the activities of SOD, POD, CAT, and contents of proline and MDA increased significantly (< 0.05). No significant changes were observed in branch number, root length and average root diameter, indicating that potato traits might have different regulatory pathways in response to drought stress and DNA demethylation. Compared with the individual treatment, combined-treatment further inhibited the growth of plantlets, and increased activities of SOD, POD, CAT, and contents of MDA and Pro under drought stress and 5-azadC treatment, indicating that the formation of some phenotypes (not all) in response to drought was regulated through the DNA methylation. The results provide preliminary data for further study on epigenetics regulatory pathway of potato under drought stress.

potato; drought stress; DNA methylation; morphological physiology; comprehensive analysis

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660432, 31460369), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(馬鈴薯)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-09-P14), 甘肅省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)體系(GARS-03-P1), 中國(guó)科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃(2014-01), 蘭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015-3-62), 甘肅省科技廳項(xiàng)目(18JR3RA170)和甘肅省教育廳高?？蒲许?xiàng)目(2018A-040)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660432, 31460369), the China Agriculture Research System (CARS-09-P14), the Gansu Potato Industry System (GARS-03-P1), the “Light of the West” Talent Training Program of the Chinese Academy of Sciences (2014-01), the Lanzhou Science and Technology Development Plan (2015-3-62), the Gansu Science and Technology Fund (18JR3RA170), and the Gansu Provincial Department of Education University Research Project (2018A-040).

白江平, E-mail:baijp@gsau.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

李鵬程, E-mail:526040572@qq.com; 畢真真, E-mail: bizhen925@sina.com

2019-02-16;

2019-05-12;

2019-06-06.

10.3724/SP.J.1006.2019.94024

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190605.1800.006.html