陳 芳 喬麟軼 李 銳 劉 成 李 欣 郭慧娟 張樹偉 常利芳 李東方 閻曉濤 任永康 張曉軍,* 暢志堅,*

小麥新種質(zhì)CH1357抗白粉病遺傳分析及染色體定位

陳 芳1喬麟軼2,3李 銳2劉 成4李 欣2,3郭慧娟2張樹偉2常利芳2李東方5閻曉濤2任永康2張曉軍2,3,*暢志堅2,3,*

1山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太原 030006;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室, 山西太原 030031;3農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室, 山西太原 030031;4山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 山東濟南 250100;5新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 新疆五家渠 831300

白粉病是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的一種主要病害。小偃麥衍生品系CH1357對白粉病具有較好的成株抗性, 苗期對27個菌株表現(xiàn)為免疫或高抗, 是一個高抗白粉病的優(yōu)異抗源。為了明確其抗白粉病基因在染色體上的位置, 對臺長29/CH1357和綿陽11/CH1357的F1、BC1及F2:3家系進行了遺傳分析, 并利用分離群體分組分析法(bulked segregant analysis, BSA)將其初步定位。CH1357的白粉病抗性受1對顯性核基因控制, 位于染色體5DS, 暫命名為。其側(cè)翼連鎖標(biāo)記為和, 在2個作圖群體臺長29/CH1357和綿陽11/CH1357中的遺傳距離分別為2.0 cM/11.3 cM和1.5 cM/8.9 cM。與5DS染色體上已報道的其他抗白粉病基因抗譜不同, 可能是一個新的抗源。

白粉病抗性; SSR標(biāo)記; 連鎖圖譜; 基因定位;

小麥(L., 2= 6= 42, AABBDD)是世界上主要糧食作物之一, 其產(chǎn)量和品質(zhì)與糧食安全密切相關(guān)。由禾本科布氏白粉菌(DC.) f. sp.()侵染引起的白粉病是限制小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的一種主要病害, 在全世界小麥主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生, 尤其是在過量使用氮肥和大量種植半矮稈小麥品種的國家盛行[1-2]。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心測報, 2018年小麥白粉病發(fā)病面積預(yù)計高達603萬公頃。其中, 對長江中下游、江淮、滇南、隴南、晉南、豫北、魯中南高產(chǎn)灌區(qū)等麥區(qū)生產(chǎn)危害尤為嚴(yán)重(http://www.natesc. org.cn/sites/cb/)。挖掘抗病基因進行小麥遺傳改良, 培育適應(yīng)當(dāng)?shù)氐目共∑贩N是控制病害最有效的措施, 對小麥種業(yè)發(fā)展和保障我國糧食安全具有重要意義[3]。

迄今為止, 國內(nèi)外已鑒定出100多個抗小麥白粉病基因或QTL, 其中已被正式命名的基因位點有64個[4]。其中, 一些已被廣泛應(yīng)用于小麥的育種和生產(chǎn), 如、、和等。然而, 由于小麥白粉菌具有菌株多樣、病菌毒性基因變異快等特點, 大多數(shù)廣泛種植的品種在推廣應(yīng)用3年至5年便開始逐漸喪失抗性[5-6]。例如, 20世紀(jì)70年代引進的小麥–黑麥T1BL·1RS易位系上抗白粉病基因的過度利用, 使得其毒性菌株的頻率直線上升, 導(dǎo)致1990年小麥白粉病大流行, 對小麥產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失[7-8]。因此, 持續(xù)挖掘和定位新的抗白粉病基因, 開發(fā)可用于分子育種的功能標(biāo)記, 進行抗病基因的合理布局, 將對小麥品種的抗性改良起到積極的推進作用。

CH1357是八倍體小偃麥小偃7430與普通小麥冀麥26雜交, 再與中8701雜交選育而來的小偃麥滲入系, 其在成株期對白粉病表現(xiàn)出優(yōu)良抗性, 苗期對多個菌株表現(xiàn)為免疫或高抗, 具有較高的育種應(yīng)用價值。本研究對CH1357的白粉病抗性進行遺傳分析, 并確定CH1357中白粉病抗性基因所在染色體的位置, 旨在為克隆并有效利用該抗源種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與白粉病菌株

白粉病苗期抗病性鑒定材料包括抗病親本CH1357 (系譜為中8701//冀麥26/小偃7430), 感病親本為臺長29 (TC29)和綿陽11 (MY11), 臺長29/CH1357的F1、BC1和483個F2:3家系, 綿陽11/CH1357的F1、BC1和411個F2:3家系。其中2個雜交組合的F2群體作為作圖群體, 其F2:3家系用于統(tǒng)計抗病性的分離比, 以確定控制白粉病抗病基因的個數(shù), F1和BC1群體的鑒定結(jié)果用于確定抗病基因的顯隱性。

、和的載體品種UIka/8*Cc、KM2939和鳥麥用于不同白粉菌株的抗性反應(yīng)比較。其中, UIka/8*Cc為前蘇聯(lián)品種; KM2939為小麥-冰草遠(yuǎn)緣雜交獲得的新種質(zhì), 其系譜為4201/CMH83. 605//FC[16]; 鳥麥為地方品種[17]。

上述遺傳群體F1、BC1和F2:3家系的抗病性鑒定在苗期進行, 所用白粉菌株為E09, 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所周益林研究員惠贈, 本實驗室通過活體幼苗保存。32個在我國中、北部小麥種植區(qū)采集并分離的白粉病菌株用于研究抗病親本CH1357對不同菌株的抗性反應(yīng)(表1), 由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心安調(diào)過博士提供。

表1 CH1357、臺長29 (TC29)和綿陽11 (MY11)苗期對32個白粉菌株的抗性反應(yīng)

1.2 苗期白粉病抗病性評價

在人工氣候室中對供試材料進行苗期白粉病抗病性鑒定。利用75%酒精溶液對種子消毒后種植于72穴育苗盤內(nèi), 每穴播5粒種子, 每個育苗盤種植8個感病品種, 臺長29作為感病對照, 以確保病害的充分發(fā)生。人工氣候室的光照強度為125 μmol m–2s–1, 光周期為12 h, 溫度控制在16~22℃, 濕度控制在65%~70%。種植約10 d后用噴霧器噴濕幼苗, 將預(yù)先繁殖好的新鮮白粉菌采用人工掃抹法對二葉期幼苗接菌, 每材料處理5株苗, 重復(fù)鑒定3次。接菌約12 d, 待對照充分發(fā)病后, 采用0~4級分級標(biāo)準(zhǔn)[9]調(diào)查每株材料的侵染類型(infection type, IT)。IT = 0為免疫; IT = 0;為近免疫; IT = 1為高抗; IT = 2為中抗; IT = 3為中感; IT = 4為高感。調(diào)查數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行c2檢驗, 以推斷抗病基因的數(shù)目及顯隱性。

1.3 基因組DNA提取及PCR擴增

三葉期剪取臺長29/CH1357和綿陽11/CH1357的F2單株葉片及親本葉片, 利用CTAB法[10-11]提取基因組DNA。采用分離群體分組分析法(bulked segregant analysis, BSA), 根據(jù)抗病調(diào)查結(jié)果隨機選取10株純合抗病植株(表型為0級和0; 且其F2:3家系植株全部為抗病)和10株純合感病植株(表型為4級且其F2:3家系植株全部為感病), 分別將其DNA等量混合建立抗病池和感病池。

根據(jù)GrainGenes (https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)公布的引物序列, 選用分布于小麥21條染色體的767對SSR引物在親本臺長29、綿陽11、CH1357以及抗病池和感病池間篩選多態(tài)性。根據(jù)篩選結(jié)果, 再補充差異標(biāo)記所在染色體的其他分子標(biāo)記。篩選的多態(tài)性引物進一步利用11個抗病單株和11個感病單株驗證, 對多態(tài)性的引物利用作圖群體進行PCR擴增。

PCR體系15 μL, 含2 μL DNA模板, 1.5 μL 10× buffer (10 mmol L–1Tris-HCl, pH 8.3, 50 mmol L–1KCl, 1.5 mmol L–1MgCl2), 0.3 μL dNTP (0.2 mmol L–1), 2 μL引物(10 μmol L–1)和0.15 μL酶。PCR擴增程序為95℃變性5 min, 95℃變性30 s, 55~62℃ (依引物退火溫度而定)復(fù)性30 s, 72℃延伸40 s, 35個循環(huán), 72℃延伸10 min, 12℃保存。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr與Bis質(zhì)量比為19∶1)電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物, 硝酸銀染后顯色照相并觀察結(jié)果。

1.4 染色體定位及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

根據(jù)分子標(biāo)記檢測結(jié)果及抗病鑒定結(jié)果, 利用Haldane函數(shù)計算目標(biāo)基因與標(biāo)記之間的遺傳距離(cM), 借助MapMaker 3.0軟件[12]構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 CH1357、臺長29和綿陽11的白粉病抗性

利用32個白粉菌株分別接種親本CH1357、臺長29和綿陽11的兩葉期幼苗, CH1357對E09等27個菌株均表現(xiàn)為免疫(IT = 0), 對B38表現(xiàn)為高抗(IT = 1), 對B51分別表現(xiàn)為中抗(IT = 2), 對B50表現(xiàn)為中感(IT = 3), 對B14和E18表現(xiàn)為高感(IT = 4); 臺長29和綿陽11對32個白粉菌株均表現(xiàn)為感白粉病(IT = 3或4)(表1)。

2.2 CH1357的白粉病抗性遺傳分析

利用E09對抗病親本CH1357、感病親本臺長29和綿陽11以及這2個抗感雜交組合的F1、BC1和F2:3家系群體進行苗期抗病性鑒定, 以分析控制CH1357中白粉病抗性基因的數(shù)目及顯隱性。2個雜交組合的正反交F1植株對E09菌株均表現(xiàn)為免疫或近免疫(IT = 0或0;), 與抗病親本CH1357的抗病反應(yīng)類型一致, 說明CH1357中的白粉病抗性受顯性核基因控制。經(jīng)χ2檢驗2個雜交組合后代BC1植株的抗、感分離比例符合孟德爾單基因遺傳(表2)。利用E09菌株對臺長29/CH1357的483個F2:3家系進行抗病性鑒定, 其中純合抗病家系為120個, 抗、感分離的家系為231個, 純合感病家系為132個, 抗性分離比例符合1∶2∶1 (χ2= 1.509,= 0.470)。利用同一白粉菌株接種CH1357的另一組合綿陽11/CH1357的411個F2:3家系, 其中純合抗病家系為108個, 發(fā)生抗、感分離的家系為208個, 純合感病家系為95個, 經(jīng)χ2檢驗符合孟德爾分離比例1∶2∶1 (χ2= 0.883,= 0.643)(表3)。上述CH1357兩個雜交組合后代的表型鑒定結(jié)果表明CH1357對白粉菌株E09的抗性由單顯性核基因控制, 將其暫命名為。

2.3 PmCH1357的染色體定位

所選的767對SSR引物中, 406對(52.9％)在親本CH1357和臺長29間存在多態(tài)性, 進一步在抗、感池間篩選多態(tài)性, 并利用抗、感小群體進行驗證, 發(fā)現(xiàn)標(biāo)記和在親本、抗感池以及抗感小群體中均能擴增出一致的多態(tài)性條帶(圖1)。通過小麥數(shù)據(jù)庫GrainGenes (https://wheat.pw.usda. gov/GG3/)及Wheat-urgi (https://wheat-urgi.versailles. inra.fr/),和位于染色體5DS。隨后, 又利用5DS上已發(fā)表的與抗白粉病基因連鎖的標(biāo)記及其他SSR引物(共91對)進一步篩選, 發(fā)現(xiàn)6對引物、、、、[13]和[14]在抗、感親本和抗、感池間具有多態(tài)性。利用上述8對引物對臺長29/CH1357的421個F2單株DNA進行擴增, 通過連鎖分析, 初步將CH1357的抗白粉病基因定位于5D染色體短臂, 其兩側(cè)鄰近標(biāo)記和的遺傳距離分別為2.0 cM和11.3 cM (圖2-a)。又用上述8對引物在綿陽11、CH1357及其抗、感病池和抗、感病小群體間進行多態(tài)性鑒定, 發(fā)現(xiàn)這些引物與綿陽11/CH1357中的抗白粉病基因連鎖。進一步對綿陽11/CH1357的341個F2單株進行DNA擴增, 通過遺傳連鎖分析, 將綿陽11/CH1357中的抗白粉病基因定位于染色體5DS, 兩側(cè)鄰近標(biāo)記為和, 遺傳距離分別為1.5 cM和8.9 cM (圖2-b)。

表2 2個作圖群體不同世代對白粉菌株E09的苗期抗性和分離比率

IT 0~2為抗病型; IT 3~4為感病型。

IT 0?2 were scored as resistance and IT 3?4 as susceptibility.

表3 2個F2:3作圖群體對白粉菌株E09的苗期抗性

圖1 SSR標(biāo)記Xcfd81和Xgwm190在CH1357 F2群體中的擴增結(jié)果

M: marker; Pr: 抗病親本CH1357; Ps: 感病親本臺長29; Br: 抗病池; Bs: 感病池; 1~6: 純合抗病株; 7~12: 純合感病株。

M: marker; Pr: resistant parent CH1357; Ps: susceptible parent Taichang 29; Br: resistant bulk; Bs: susceptible bulk; 1?6: homozygous resistant plants; 7?12: homozygous susceptible plants.

圖2 PmCH1357在群體臺長29/CH1357 (a)與綿陽11/CH1357 (b)中的遺傳定位及其與Pm2位點其他基因的比較

2.4 PmCH1357與染色體5DS上其他抗白粉病基因的比較

利用與連鎖的8對引物對、、的載體品種UIka、KM2939、鳥麥進行DNA擴增, 發(fā)現(xiàn)5對標(biāo)記(、、、和)在CH1357和3個抗白粉病基因的載體品種中的擴增條帶都一致(圖3)。

利用12個白粉菌株對、、和的載體品種進行苗期白粉病抗性鑒定(表4)表明, CH1357對B38、B40、B51分別表現(xiàn)為高抗、免疫和中抗, 而UIka/8*Cc ()對該3個菌株均表現(xiàn)為中感; CH1357對E18、E21分別表現(xiàn)為高感和免疫, 而KM2939 ()對E18、E21的抗性反應(yīng)分別為高抗和中感; CH1357對B14、E14均表現(xiàn)為高感, 而鳥麥()對B14、E14的抗性反應(yīng)均為免疫。可見與、和對12個白粉菌株的抗性反應(yīng)明顯不同。

3 討論

小麥白粉病菌株具有群體大、變異快等特點, 在抗源單一的情況下, 長期廣泛種植含單一抗病基因的品種, 一旦出現(xiàn)新的毒性菌株, 會導(dǎo)致抗病基因的抗性喪失, 引起小麥白粉病大流行, 從而對小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[5-6]。目前雖然定位了大量的小麥主效抗白粉病基因, 但其中許多已對優(yōu)勢白粉病菌株喪失抗性, 可有效用于生產(chǎn)上的抗病基因甚少。因此, 不斷挖掘新的抗白粉病基因, 保持抗病基因抗源的多元化至關(guān)重要。

利用我國中、北部搜集的32個白粉菌株對CH1357進行苗期白粉病抗性鑒定, CH1357對其中的29個菌株具有抗性(表1)。由此可見, CH1357對我國中、北部的白粉病具有廣譜型抗性, 在生產(chǎn)上具有較大的應(yīng)用潛力。通過對臺長29/CH1357和綿陽11/CH1357的2個F2分離群體進行抗病性遺傳分析和抗病基因的鑒定, 發(fā)現(xiàn)CH1357的白粉病抗性受一對顯性核基因控制, 其抗病基因位于5DS染色體上。由于單基因遺傳一般對病原菌表現(xiàn)為垂直抗性, 極容易被新的病原菌致病型所克服, 因此CH1357在生產(chǎn)上應(yīng)用時應(yīng)當(dāng)注意, 應(yīng)盡量避免單獨使用, 與其他抗病基因結(jié)合使用, 可以有效增加品種的抗病性, 并延長其抗病持久性。

圖3 CH1357中連鎖標(biāo)記與染色體5DS上部分已知抗白粉病基因的比較

M: marker; 1: 臺長29; 2: CH1357; 3: UIka () ; 4: KM2939 (); 5: 鳥麥()。

M: marker; 1: Taichang 29; 2:CH1357; 3: UIka (); 4: KM2939 (); 5: Niaomai ().

目前, 已在小麥5DS染色體上鑒定出多個抗白粉病基因, 如來源于前蘇聯(lián)品種UIka的[15], 冰草衍生品系KM2939和PB3558的[16]和[13], 小麥地方品種鳥麥的[17], 中國品種良星66、中麥155、汶農(nóng)14、嬰泊700和Subtil的[18]、[19]、[18]、[20]和[21]以及來源于德國品種Tabasco的[22]、法國品種FG-1的[23]和英國品種Brock的等[24]。其中、、、、等可能是的等位基因, 但不是的等位基因, 因為利用15個白粉病菌株對Tabasco′Ulka/8*Cc (Chancellor)雜交的F2群體進行等位性測驗發(fā)現(xiàn)這2個基因?qū)y驗菌株的抗性反應(yīng)不同[23]。上述報道中的抗白粉病基因都與分子標(biāo)記緊密連鎖(圖2), 其中與標(biāo)記的遺傳距離為2.0 cM (圖2-c),為1.3 cM (圖2-d),為0.1 cM (圖2-e),為5.5 cM,為2.8 cM,為3.6 cM,為1.8 cM,為0.9 cM,為0.9 cM,為3.1 cM,為0.3 cM,為0.1 cM, 而在2個遺傳群體中與標(biāo)記的遺傳距離分別為2.0 cM和1.5 cM。因此, 推測可能也位于位點或附近。在2個作圖群體中連鎖標(biāo)記的順序和遺傳距離不完全相同, 可能是遺傳背景差異造成的。

在同一染色體位點存在多個等位基因這一現(xiàn)象并不罕見。小麥白粉病抗性中, 已在[25]、[17]、[26]、[27]、[28]和[29]位點鑒定出多個抗病等位基因。迄今為止, 已在基因座上鑒定出17個功能等位基因。類似于, 在基因座上鑒定出越來越多的等位基因, 豐富了該位點的多樣性。與是否具有等位關(guān)系, 尚需經(jīng)過等位性測試進行證明。Sanchez- Martin等[30]利用突變體測序的方法獲得了位點上的1個功能基因, 根據(jù)該基因序列設(shè)計引物擴增本研究中的抗病材料, 結(jié)果顯示二者序列并無差異。而與、和對不同白粉菌株的抗病反應(yīng)存在明顯差異(表4), 推測與5DS上的其他抗白粉病基因不同, 可能是一個新的抗源。其連鎖的分子標(biāo)記, 可用于分子標(biāo)記輔助選擇(MAS), 提高育種效率。

表4 CH1357與染色體5DS上已知抗白粉病基因?qū)?2個白粉菌株的抗性反應(yīng)比較

4 結(jié)論

小麥種質(zhì)CH1357對我國不同地區(qū)采集的32個白粉菌株中的27個表現(xiàn)為免疫或近免疫, 可作為我國黃淮及北部冬麥區(qū)的白粉病優(yōu)質(zhì)抗源, 其白粉病抗性受1對顯性核基因控制, 暫命名為, 并將其抗病基因初步定位于小麥5DS染色體, 兩側(cè)連鎖標(biāo)記和的遺傳距離分別為2.0 cM/11.3 cM和1.5 cM/8.9 cM, 推斷與染色體5DS上的其他抗白粉病基因不同, 可能是一個新的抗源。

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Genetic analysis and chromosomal localization of powdery mildew resistance gene in wheat germplasm CH1357

CHEN Fang1, QIAO Lin-Yi2,3, LI Rui2, LIU Cheng4, LI Xin2,3, GUO Hui-Juan2, ZHANG Shu-Wei2, CHANG Li-Fang2, LI Dong-Fang5, YAN Xiao-Tao2, REN Yong-Kang2, ZHANG Xiao-Jun2,3,*, and CHANG Zhi-Jian2,3,*

1College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi, China;2Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement, Taiyuan 030006, Shanxi, China;3Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau of Ministry of Agriculture, Taiyuan 030006, Shanxi, China;4Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China;5Sixth Agricultural Division Agricultural Science Research Institute of Xinjiang Production and Construction Crops, Wujiaqu 831300, Xinjiang, China

Powdery mildew is a serious disease affecting yield and quality of wheat. Wheat-introgression line CH1357 is highly resistant tof. sp.() at the adult plant stage and immune or highly resistant to 27isolates at the seedling stage. Two mapping populations (F1, BC1, and F2:3) derived from Taichang 29/CH1357 and Mianyang 11/CH1357 were used to map the powdery mildew resistance gene by the bulked segregant analysis. The powdery mildew resistance in CH1357 was controlled by a single dominant gene, temporarily named. This gene was located on the short arm of chromosome 5D and linked to SSR markersand, with genetic distances of 2.0 cM and 11.3 cM in the Taichang 29/CH1357 population and 1.5 cM and 8.9 cM in the Mianyang 11/CH1357 population, respectively.differs from othergenes reported on chromosome 5DS in resistance spectrum, which may be a new source of resistance.

resistance to powdery mildew; SSR markers; linkage map; gene mapping;

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100600), 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院項目(YGG17123, YCX2018D2YS01), 山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2017MC004), 山西省重點研發(fā)計劃項目(201703D211007, 201803D221018-5, 201803D421020)和山西省重點科技創(chuàng)新平臺(201605D151002)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0100600), Shanxi Academy of Agricultural Sciences (YGG17123, YCX2018D2YS01), the National Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2017MC004), the Key Research and Development Program of Shanxi Province (201703D211007, 201803D221018-5, 201803D421020), and the Key Scientific and Technological Innovation Platform (201605D151002).

張曉軍, E-mail: zxjemail@163.com; 暢志堅, E-mail: wrczj@126.com, Tel: 0351-7130805

E-mail: chenfang8857@126.com

2019-01-18;

2019-05-12;

2019-05-21.

10.3724/SP.J.1006.2019.91011

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20190517.1713.009.html