樊麗　劉鵬濤　劉新亮

摘 要：以納米微晶纖維素（NCC）為載體、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）為分散劑，利用葡萄糖還原硝酸銀以制備納米銀顆粒，得到載銀納米微晶纖維素溶液。利用紫外可見分光光度計(jì)、透射電子顯微鏡、X射線衍射儀對(duì)載銀納米微晶纖維素溶液進(jìn)行表征。結(jié)果表明，由此體系制備的載銀納米微晶纖維素中納米銀顆粒平均粒徑為10～20 nm，為晶體結(jié)構(gòu)，且分散均勻。利用抑菌圈法對(duì)載銀納米微晶纖維素的抗菌性能進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等均有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：納米微晶纖維素;納米銀;抗菌性

中圖分類號(hào)：TS721;TQ352

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.11981/j.issn.1000-6842.2019.02.08

細(xì)菌、霉菌等對(duì)人體有害的微生物在自然界廣泛存在，人們?cè)絹?lái)越注重自身的生活、健康和安全，因此對(duì)抗菌材料的需求也日益增長(zhǎng)。抗菌材料是一種自身具有抑菌或殺菌的功能性材料，核心成分是抗菌劑[1-3]（對(duì)細(xì)菌、霉菌等微生物具有高度敏感的化學(xué)成分）。纖維素是大自然饋贈(zèng)給人類的豐富的可再生資源[4]。將纖維素分子控制在納米級(jí)別尺寸，添加抗菌劑可合成具有抗菌性的納米級(jí)新型材料。

王海英等[5]用硼氫化鈉還原硝酸銀，還原反應(yīng)生成的單質(zhì)銀吸附在纖維素表面，制得的這種纖維素/銀納米粒子水溶膠具有良好的抗菌性。宋建恒等[6]以過氧化氫為還原劑、有機(jī)胺為分散劑、從強(qiáng)堿中還原硝酸銀以制備超細(xì)銀粉?？总岳虻萚7]以羧甲基纖維素鈉為還原劑、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）為分散劑，還原硝酸銀以制備納米銀顆粒。相比于以硼氫化鈉等為還原劑，以葡萄糖為還原劑對(duì)生物和環(huán)境沒有危害，是制備納米銀粒子的“綠色”還原劑。在納米銀的制備中，納米銀晶核表面與非離子型表面活性劑PVP分子中的O原子形成鍵合，向四周伸展的C—H長(zhǎng)鏈可以有效地防止納米銀粒子之間的團(tuán)聚[8]，使生成的銀原子可以均勻地吸附在納米銀晶核表面，得到呈球型的納米銀顆粒。本研究以本身具有分散性的納米微晶纖維素（NCC）為載體[9-10]、PVP為分散劑，利用葡萄糖還原硝酸銀，在納米微晶纖維素表面原位制備納米銀顆粒，得到抗菌性載銀納米微晶纖維素材料，該材料在薄膜、凝膠等材料的抗菌及增強(qiáng)方面應(yīng)用前景廣闊[11-13]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

納米微晶纖維素（nanocrystalline cellulose，NCC），實(shí)驗(yàn)室自制[14]，長(zhǎng)度150 nm，直徑5 nm，表面電荷-1.121 mmol/g;硝酸銀（AgNO3）、葡萄糖（C6H12O6）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氫氧化鈉（NaOH）、濃硫酸（H2SO4）、氯化鈉（NaCl）、無(wú)水乙醇，均為分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司;蛋白胨、酵母粉、瓊脂為生物試劑;大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S.aurieus），天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院培養(yǎng)。

1.2 儀器

AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;IKA RW20，天津蒙德有限公司;CAX41型電熱恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)鳳儀器有限公司;TGL-20M臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司;pH-3C型pH計(jì)，天津盛邦科學(xué)儀器技術(shù)公司;JEOL-2010透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社;UV-2550 PC紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司;XRD-6100X射線衍射儀，日本島津公司;BI-150A低溫生化培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 載銀納米微晶纖維素的制備

稱取0.10 g的PVP，在60℃的水浴中加熱，緩慢攪拌使其溶解在90.00 mL的蒸餾水中，得到PVP溶液，室溫放置備用。精確稱取一定量硝酸銀，溶解于10.00 mL蒸餾水中，形成硝酸銀水溶液，避光放置室溫中備用。稱取0.40 g的氫氧化鈉，使其溶解在10.00 mL蒸餾水中。在水浴條件下，向50.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的納米微晶纖維素溶液中加入配置好的PVP溶液，在不斷攪拌的條件下，將氫氧化鈉溶液逐滴加入到混合溶液中，調(diào)節(jié)pH值為8。然后再加入一定量的葡萄糖，將溫度快速升至80℃，不斷攪拌，并逐滴加入配置好的硝酸銀溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，得到載銀納米微晶纖維素溶液。將所得溶液用無(wú)水乙醇和蒸餾水進(jìn)行離心洗滌，并進(jìn)行超聲處理。

1.3.2 載銀納米微晶纖維素的表征

（1）微觀形貌觀測(cè) 采用JEM-2010型透射電鏡觀察載銀納米微晶纖維素的形態(tài)。將樣品稀釋后，超聲分散于無(wú)水乙醇中，并用吸管將高度分散的超聲液滴在超薄銅網(wǎng)上，加速電壓為200 kV。

（2）結(jié)晶度測(cè)定 采用Bruker D8型X射線衍射儀分析載銀納米微晶纖維素的結(jié)晶形態(tài)。用Cu-Kα射線（λ=1.54 ）進(jìn)行輻射，掃描范圍5°～85°，掃描速度2°/min。并用Segal法計(jì)算結(jié)晶度，見式（1）：

Cr=（Iα-IβIα）×100%（1）

式中，Cr代表相對(duì)結(jié)晶度百分比;Iα代表結(jié)晶區(qū)的最大衍射強(qiáng)度;Iβ代表衍射角2θ=18°時(shí)的衍射強(qiáng)度。

（3）紫外光譜測(cè)定 采用UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)分析載銀納米微晶纖維素在不同條件下的特征吸收峰。

1.3.3 載銀納米微晶纖維素的抗菌性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)用的菌種為大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus），因此選用適合細(xì)菌生長(zhǎng)的LB固體培養(yǎng)基。具體測(cè)試步驟如下：將蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、氯化鈉10.00 g、瓊脂15.00 g溶于1000.00 mL蒸餾水中，用煮沸的且濃度為0.10 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5。使用培養(yǎng)基前，將槍頭、試管、培養(yǎng)皿等放入滅菌爐中在121℃下滅菌20 min后，放置無(wú)菌操作臺(tái)紫外燈下冷卻至50℃。將滅菌后的培養(yǎng)基倒置于培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌操作臺(tái)紫外燈的照射下至培養(yǎng)基充分凝固，再利用劃線法把菌種放置于裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，把直徑為6 mm的圓形濾紙浸泡在不同濃度的載銀納米微晶纖維素溶液中，一定時(shí)間后取出，干燥后放入培養(yǎng)皿中央，將上述培養(yǎng)皿放置細(xì)菌培養(yǎng)箱中于36℃培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落形態(tài)，并測(cè)量抑菌圈直徑，求其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 載銀納米微晶纖維素的表征

2.1.1 微觀形貌分析

采用透射電子顯微鏡觀察載銀納米微晶纖維素的形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。從圖1（a）可以看出，反應(yīng)體系未加入PVP時(shí)，納米銀顆粒出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，根據(jù)能量最低原理，因?yàn)榧{米銀粒子具有較大的比表面積，所以容易發(fā)生團(tuán)聚;從圖1（b）可以看出，反應(yīng)體系加入0.10 g PVP后，納米銀顆粒分散均勻，直徑均勻分布在10～20 nm，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象;圖1（c）是加入0.10 g PVP的載銀納米微晶纖維素的TEM圖，可以看出，納米銀在納米微晶纖維素上負(fù)載量多，且分散均勻，同時(shí)也可以看出，納米微晶纖維素呈棒狀結(jié)構(gòu)，交織成網(wǎng)狀。PVP可促進(jìn)納米銀顆粒成核，防止晶粒長(zhǎng)大，其有機(jī)長(zhǎng)鏈的空間位阻作用使相互結(jié)合的納米銀顆粒表面隔開，阻止納米銀粒子團(tuán)聚。

2.1.2 結(jié)晶度分析

圖2所示為在80℃、以0.10 g的PVP為分散劑、2.00 g的葡萄糖為還原劑、0.17 g的硝酸銀、反應(yīng)時(shí)間為4 h的條件下制得的載銀納米微晶纖維素的X射線衍射（XRD）圖譜。由圖2可知，載銀納米微晶纖維素在2θ=38.3°、44.5°、64.5°、78.7°處有4個(gè)明顯的衍射峰，這與JCPDS卡04-0783上的數(shù)據(jù)一致，分別對(duì)應(yīng)面心立方晶系單質(zhì)Ag（111）、Ag（200）、Ag（220）和Ag（311）晶面的衍射峰[15]。該曲線衍射峰相當(dāng)尖銳，表明銀的結(jié)晶性能較好。由圖2還可看出，納米微晶纖維素的特征衍射峰在2θ=16.5°、22.5°、34.7°處有3個(gè)明顯的衍射峰，分別對(duì)應(yīng)纖維素（101）（002）（040）晶面的衍射峰，說明納米微晶纖維素和納米銀顆粒的相互混合并未改變各自的晶型。

2.1.3 紫外光譜分析

在80℃、以0.10 g的PVP為分散劑、2.00 g的葡萄糖為還原劑、0.17 g的硝酸銀、不同反應(yīng)時(shí)間條件下制得的載銀納米微晶纖維素的顏色如圖3（a）所示。由圖3（a）可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，載銀納米微晶纖維素溶液顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)槲ⅫS色、黃棕色、紅棕色、棕褐色等，說明生成了不同粒徑的納米銀顆粒。利用紫外分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定納米銀的生成過程，不同反應(yīng)時(shí)間下生成納米銀的紫外吸收光譜圖如圖3（b）所示。從圖3（b）可很清楚地看出，在300～700 nm區(qū)間出現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)的特征吸收峰，其最大吸收波長(zhǎng)位于420 nm，表明硝酸銀中的銀離子成功被還原為納米銀粒子。對(duì)于金屬膠體而言，其吸收峰的半峰寬越寬，粒子尺寸的分布就越寬。反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，納米銀的半峰寬較寬，說明此時(shí)的納米銀顆粒的粒徑分布較寬，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，納米銀吸收峰的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，說明生成的納米銀顆粒的濃度也在不斷增加。同時(shí)可以很明顯地發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其相對(duì)應(yīng)的吸收峰位置不斷藍(lán)移，從420 nm藍(lán)移到416 nm，對(duì)應(yīng)的半峰寬的寬度變窄，表明納米銀顆粒的平均粒徑不斷減小，并且粒徑分布也不斷變窄。反應(yīng)4 h后，所對(duì)應(yīng)的吸收峰位置和強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定，表明還原反應(yīng)基本結(jié)束。

葡萄糖分子中含有5個(gè)羥基和1個(gè)醛基，醛基具有還原性，在水浴加熱的條件下可把銀化合物溶液中的銀離子還原成銀單質(zhì)，自身則被氧化為羧基。葡萄糖作為還原劑，其用量對(duì)納米銀粒子的粒徑和形貌有顯著影響。圖4為在80℃、以0.10 g的PVP為分散劑、0.17 g的硝酸銀、反應(yīng)時(shí)間為4 h，不同葡萄糖用量條件下載銀納米微晶纖維素的紫外吸收光譜圖。當(dāng)葡萄糖用量較少時(shí)，生成的納米銀粒子為淡黃色，葡萄糖未能還原足夠多的硝酸銀，此時(shí)納米銀顆粒的特征吸收峰位置在423 nm（曲線a）處。當(dāng)葡萄糖用量為3 g時(shí)，生成的納米銀顆粒的顏色為棕褐色，此時(shí)其紫外吸收峰的位置在419 nm（曲線c）處。另外，隨著葡萄糖用量的逐漸增多，納米銀顆粒紫外吸收峰的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，原子態(tài)的銀聚集長(zhǎng)大形成晶核，形成納米銀顆粒，葡萄糖用量越多，被還原的銀離子越多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提高葡萄糖用量，可提高納米銀顆粒的產(chǎn)量。

圖5為在80℃、以0.10 g的PVP為分散劑、2.00 g的葡萄糖為還原劑、反應(yīng)時(shí)間為4 h，不同硝酸銀濃度條件下制備得到載銀納米微晶纖維素的紫外吸收光譜圖。由圖5可知，當(dāng)硝酸銀濃度為0.0125 mol/L時(shí)，生成淺黃色的納米銀顆粒，其紫外可見光譜吸收峰的位置在418 nm處（曲線a），對(duì)應(yīng)的納米銀半峰寬較寬，表明生成的納米銀顆粒粒徑分布較寬。當(dāng)硝酸銀濃度增加到0.1000 mol/L時(shí)，生成的納米銀粒子呈紅棕色，其紫外可見光譜吸收峰的位置在415 nm處（曲線d）。晶體的形成是一個(gè)晶粒成核與生長(zhǎng)的過程，通過控制成核速率和生長(zhǎng)速率兩者之間的平衡來(lái)調(diào)節(jié)晶體形貌和尺寸;當(dāng)生長(zhǎng)速率相對(duì)較小而成核速率相對(duì)較大時(shí)，可以生成粒徑小的晶粒。當(dāng)硝酸銀濃度增加時(shí)，納米銀晶體的成核速率較大，生長(zhǎng)速率小，生成的晶粒粒徑較小。另外，隨著硝酸銀濃度的增加，納米銀顆粒紫外可見光譜吸收峰的強(qiáng)度也不斷增強(qiáng)，由此可知，硝酸銀濃度與納米銀顆粒的產(chǎn)量和粒徑相關(guān)性很大，硝酸銀濃度越大，納米銀顆粒的產(chǎn)量越高而粒徑越小。

2.2 載銀納米微晶纖維素的抗菌性

納米銀是一種具有大比表面積和小粒徑的納米顆粒，可以快速吸附在細(xì)菌的細(xì)胞膜表面，影響細(xì)菌正常的生理功能（如呼吸功能等），從而快速殺死細(xì)菌[16]。此外，納米銀粒子可以通過滲透細(xì)菌的細(xì)胞膜，并與含有S、P等元素的大分子化合物（如核酸、RNA、DNA）作用的方式，抑制細(xì)菌的自我復(fù)制，從而殺死細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）作為實(shí)驗(yàn)菌種，采用抑菌圈法[17]對(duì)載銀納米微晶纖維素的抗菌性能進(jìn)行檢測(cè)。

在不同硝酸銀濃度（0.0125、0.0250、0.0500、0.1000 mol/L）條件下制備載銀納米微晶纖維素。離心超聲處理后，對(duì)E.coli和S.aureus進(jìn)行抗菌性能檢測(cè)，結(jié)果如表1和圖6所示。

由表1和圖6可知，將硝酸銀濃度從0.0125 mol/L提高到0.1000 mol/L，抑菌圈會(huì)逐漸變大，說明高濃度硝酸銀條件下生成的納米銀顆粒較多，其抑菌效果較明顯。當(dāng)硝酸銀濃度為0.1000 mol/L時(shí)，抑菌圈直徑較大，抑菌效果最明顯，載銀納米微晶纖維素對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑最大為19.8 mm，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大為20.1 mm。綜上所述，載銀納米微晶纖維素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。

3 結(jié) 論

以實(shí)驗(yàn)室自制的納米微晶纖維素為載體、聚乙烯吡咯烷酮為分散劑和保護(hù)劑、葡萄糖為還原劑并與硝酸銀反應(yīng)以制備載銀納米微晶纖維素。所生成的納米銀顆粒直徑在10～20 nm之間，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，其在納米微晶纖維素中分布均勻;X射線衍射分析結(jié)果表明，納米銀的結(jié)晶性能較好，其結(jié)構(gòu)為多晶體系;隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，納米銀顆粒的粒徑不斷減小，粒徑分布不斷變窄;隨著葡萄糖用量增加，被還原的銀離子越多，原子態(tài)的銀聚集長(zhǎng)大成核，形成納米銀;隨著硝酸銀濃度增加，納米銀晶體成核速率較大，生長(zhǎng)速率小，生成的晶粒粒徑較小。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著硝酸銀濃度增加，抑菌圈逐漸變大，表明載銀納米微晶纖維素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用。

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Preparation and Characterization of Silver-loaded Nanocrystalline Cellulose

FAN Li1 LIU PengtaoLIU Xinliang2

（1. Tianjin Key Laboratory of Pulp and Paper， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin， 300457;

2. Guangxi Key Laboratory of Clean Pulp & Papermaking and Pollution Control， Nanning， Guangxi Zhuang Autonomous Region， 530004）

（*E-mail：pengtaoliu@tust.edu.cn）

Abstract：The silver nanoparticles were prepared using nanocrystalline cellulose （NCC） as the carrier， PVP as the dispersant， glucose as the reducing agent， and silver nitrate as the source of silver. Then the silver-loaded nanocrystalline cellulose solution was prepared in situ and was characterized by UV-Vis spectrophotometer， transmission electron microscopy and X-ray diffractometer. The results showed that the average particle size of silver nanoparticles in the silver-loaded nanocrystalline cellulose system was 10～20 nm， which was crystal structure and uniformly dispersed， and had good antibacterial properties. The antibacterial performance of the silver-loaded nanocrystalline cellulose was tested by the bacteriostatic zone method and the system showed good inhibitory effects on E.coli and S.aureus.

Keywords：nanocrystalline cellulose; nano-silver; antibacterial