賀豐 朱立國 趙赫

摘要 目的：運用網(wǎng)絡(luò)藥理學理念和技術(shù)研究“川芎-延胡索”藥對的主要活性成分、靶點和藥理學作用機制。方法：通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合口服生物利用度和類藥性分析，篩選出川芎和延胡索的主要成分、靶點信息，采用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，獲取的靶點信息，篩選核心靶點。利用DAVID在線分析工具對靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和KEGG通路分析。結(jié)果：從“川芎-延胡索”藥對中篩選得到58個主要活性成分，相關(guān)作用于靶點220個，主要涉及在癌癥、信號傳導、免疫、細胞通訊及凋亡等生物學過程中的多條信號通路。結(jié)論：本研究初步揭示了“川芎-延胡索”藥對的主要活性成分、靶點及協(xié)同作用機制，為進一步深入探討其藥理學作用提供了參考。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學;川芎;延胡索;作用機制

Abstract Objective：To study the main active ingredients，targets and pharmacological mechanism of “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis” drug pair based on network pharmacology.Methods：The chemical components and targets related to Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis were researched from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）according to oral bioavailability（OB）and drug likeness（DL）.Cytoscape 3.6.0 software was used to build the active ingredient-target network model and screen for core targets.The GO and KEGG pathways in the targets were analyzed by DAVID.Results：58 active components were screened from “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis” drug pair，involving 220 related action targets.It mainly involved multiple signaling pathways such as cancer，signal transduction，immunity，cell communication and apoptosis signaling pathways.Conclusion：This paper preliminarily revealed the main active ingredients，targets and synergistic mechanism of the herbal pair of “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis”，providing a reference for further exploration of its pharmacological effects.

Key Words Network pharmacology; Rhizoma Ligustici Chuanxiong; Rhizoma Corydalis; Action mechanism

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.009

“川芎-延胡索”為經(jīng)典的臨床搭配使用藥物組合。川芎性屬辛溫，具有活血化瘀，行氣開郁，祛風止痛的作用。臨床上婦科主要用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血疼痛;內(nèi)科常用于胸脅疼痛、頭痛眩暈;骨科常用于寒濕痹痛、跌打損傷。延胡索性溫，味辛、苦;具有活血散瘀、理氣止痛功效。臨床常用于胸脅、腕腹疼痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌撲腫痛。目前有關(guān)川芎和延胡索兩味藥材與疾病的關(guān)系，多從單一通路或靶點研究。對于二者搭配后出現(xiàn)的多通路、多靶點對疾病影響的研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學（Network Pharmacology）是近年來較為熱門的一種研究方法，它使用網(wǎng)絡(luò)分析計算后，將“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用關(guān)系，以直觀圖形呈現(xiàn)，更好的揭示多成分藥物協(xié)同作用的特點[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學的前瞻性、整體性特點還在指導新藥研發(fā)[2]，復方方劑的配伍規(guī)律探尋方面發(fā)揮了作用[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，結(jié)合基因功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），預測“川芎-延胡索”藥對的活性成分、作用靶點、相關(guān)通路，以期更好的闡明“川芎-延胡索”配伍作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）;David 6.8生物信息學分析數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）;Cytoscape軟件（版本：3.6.0）;GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件。

1.2 “川芎-延胡索”藥對活性成分的篩選 通過TCMSP平臺和文獻檢索2種方法收集川芎、延胡索兩味藥物中所含的化學成分。然后根據(jù)各個成分的吸收、分布、代謝與排泄（ADME）性質(zhì)選出川芎、延胡索可能的活性成分，再查閱文獻補充被淘汰或遺漏的有效成分，以增加預測結(jié)果的可信度。

1.3 “活性成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 ?再次通過TCMSP平臺檢索“1.2”中篩選出的活性成分的潛在靶點，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將潛在靶點蛋白名稱校正為物種為人的官方名稱（Officical Symbol）。利用Cytoscape3.6.0統(tǒng)計軟件構(gòu)建“活性成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)模型并使用Network Analyzer插件對網(wǎng)絡(luò)進行分析，查明網(wǎng)絡(luò)中化合物和靶點的權(quán)重。

1.4 “川芎-延胡索”藥對蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org，Version 10.5）[4]是一個收集了大量蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，其中包含了經(jīng)過實驗驗證和通過生物信息學方法預測得到的數(shù)據(jù)，共涉及9 643 763個蛋白，1 380 838 440個相互作用。將“川芎-延胡索”藥對活性成分作用的蛋白靶點導入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果保存成TSV格式，導入Cytoscape3.6.0統(tǒng)計軟件繪制相互作用網(wǎng)路。首先對此蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行總體分析，然后使用Cytoscape3.6.0統(tǒng)計軟件中的cytohubba插件確定最重要的10個蛋白互作關(guān)系，計算方法的選擇最大團中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）[5]。

1.5 基因功能和信號通路分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫，對“川芎-延胡索”藥對作用靶點進行GO和KEGG Pathways分析，GO分析中選擇生物學過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）3個內(nèi)容。保存結(jié)果后，閾值設(shè)置為Pvalue<0.05，PDF<0.05進行篩選，并按照涉及的靶點數(shù)目多少進行排序，GO分析結(jié)果用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件繪制條形圖，KEGG Pathway，用R語言繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 “川芎-延胡索”藥對中活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以“川芎”“延胡索”為關(guān)鍵詞分別進行查詢，結(jié)果顯示（截止到2018年10月），與川芎有關(guān)的化學成分有189個，與延胡索有關(guān)的化學成分有77個。本研究根據(jù)化學成分的ADME性質(zhì)，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18為條件對有關(guān)化合物進行篩選[6]，結(jié)果川芎得到7個，延胡索得到49個。為了確保結(jié)果的全面性及可靠性，再次通過文獻查找川芎及延胡索有效化合物。文獻記載川芎的化學成分包含苯酞及其二聚體、生物堿、有機酸、多糖以及腦苷脂和神經(jīng)酰胺等類成分[7-8]，其中藁本內(nèi)酯（ligustilide）被認為是苯酞類化合物中主要的活性化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用;阿魏酸（Ferulic Acid）是有機酚酸類代表化合物，在阿爾茨海默病、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等方面研究較多;川芎嗪（tetramethylpyrazine）屬于生物堿，其研究主要集中在缺血再灌注損傷、細胞凋亡等領(lǐng)域[9];因此，川芎有效化合物共計10個。查閱文獻發(fā)現(xiàn)延胡索化學成分包含生物堿、淀粉、樹脂、揮發(fā)油、多糖等，經(jīng)TCMSP篩選后包括了經(jīng)過驗證有效成分，因此川芎-延胡索藥對篩選后共得到58個（含有一個共同成分）活性成分。見表1。

2.2 “活性成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找“表1”中活性成分的潛在靶點。通過Cytoscape 3.6.0統(tǒng)計軟件繪制“川芎-延胡索”藥對的“活性成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。圖中三角形代表活性成分，圓形代表作用靶點。藍色代表川芎活性成分及靶點，紅色代表延胡索活性成分及靶點，紫色代表二者共同活性成分及作用靶點，且具有互作關(guān)系的節(jié)點間用直線連接。一個節(jié)點的度值（degree）代表與該節(jié)點相連接的邊的條數(shù)，度值的大小即代表著與對應(yīng)節(jié)點的連接程度，亦即在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵度，圖中節(jié)點的大小與度值相對應(yīng)。此網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中包含了277個節(jié)點和1 161條邊，277個節(jié)點中包括57個化學成分和220個作用靶點?；瘜W成分中延胡索49個，川芎9個（senkyunone在TCMSP數(shù)據(jù)庫中無靶點蛋白因此未在圖中顯示），及1個共有成分（sitosterol）。作用靶點中，延胡索有167個單獨潛在作用靶點，川芎有8個單獨潛在作用靶點，“川芎-延胡索”藥對共有成分潛在作用靶點3個，非共有成分共同潛在作用靶點42個”。川芎-延胡索”藥對每個活性成分平均作用于20.37（1 161/57）個靶點，每個靶點平均接受5.3（1 161/220）個藥物作用，反映了藥物和靶點多重互作的復雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。從圖1可以看出，MOL000098槲皮素（quercetin）擁有最多的潛在靶點151個，其次是MOL000790異紫堇杷明（Isocorypalmine）和MOL000217（S）-斯氏紫堇堿[（S）-Scoulerine]都有36個潛在靶點。這些靶點高的化合物可能在“川芎-延胡索”藥對的藥理功能中發(fā)揮著相對重要的作用。另外，在220個潛在靶標中，有73個靶點與2個及以上化合物分子相連接，說明同一個靶點也能同時接受多個化合物對其調(diào)控，同樣呈現(xiàn)出中藥多成分、多靶點、整合調(diào)節(jié)的作用特點。在所有靶點中，PTGS2（前列腺素過氧化物合酶2）、PTGS1（前列腺素過氧化物合酶1）、SCN5A（5型鈉通道α亞基）擁有最多的配體，分別為48、44、44個。

2.3 “川芎-延胡索”藥對蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果詳見圖2，圖中節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)，藍色代表川芎相關(guān)靶點，紅色代表延胡索相關(guān)靶點，紫色代表二者共同作用靶點，且圖中節(jié)點的大小與其連接度成正比。圖中共涉及212個節(jié)點，3 762條邊（其中F10a、GYRB、IGHG1、PRXC1A、TOP2、、CDKN2未在數(shù)據(jù)庫中找到，DIO1、DCAF與其他蛋白沒有相互作用，這8個蛋白不在相互作用網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)）。使用cytohubba插件中MCC方法計算后，確定最重要的10個蛋白互作關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。

2.4 靶點的GO富集分析及信號通路分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫，對相關(guān)靶點進行GO和KEGG pathway富集分析，閾值設(shè)置為Pvalue<0.05，F(xiàn)DR<0.05。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，“川芎-延胡索”作用的靶點基因主要富集在412個BP、28種MF和20類CC中。圖4～6分別列出了顯著性較高的前10種。圖4顯示，藥對的靶點主要富集在調(diào)控細胞增殖、有機物應(yīng)答、細胞內(nèi)信號級聯(lián)、調(diào)調(diào)控細胞凋亡、控細胞死亡、正向調(diào)控分子功能、正向調(diào)控催化活性、內(nèi)源性刺激應(yīng)答、傷害應(yīng)答、激素刺激應(yīng)答等;在分子功能方面見圖5，主要富集在相同的蛋白結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白二聚活性、酶結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、胺結(jié)合、胺受體活性、藥物結(jié)合、配體依賴性核受體活性等方面;在細胞組分中細胞膜、細胞外區(qū)域、細胞質(zhì)基質(zhì)所占比例最大。見圖6。

此外，KEEG分析共得到24條信號通路。見圖7。圖7中圓點的顏色與大小由相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量和P值決定。通過圖7分析可知“川芎-延胡索”藥對主要涉及癌癥信號通路、信號傳導相關(guān)通路、免疫相關(guān)信號通路、細胞通訊相關(guān)通路及細胞生長和死亡相關(guān)通路。

3 討論

中藥具有多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣性的特點，以往單一成分或靶標的研究方法難以反映中藥的系統(tǒng)性[10]，并且按照中醫(yī)理論開具的中藥處方可能不是簡單的各自藥效的疊加，還會產(chǎn)生復雜的協(xié)同或衰減作用[11]，網(wǎng)絡(luò)藥理學從相互連接的角度研究問題，并整合中藥、蛋白、基因、疾病等多種數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學手段分析問題，探索藥物作用機制，其整體性、系統(tǒng)性的特點與中藥的特點不謀而合。川芎和延胡索是經(jīng)典的臨床搭配使用藥物組合，尤其在婦科和骨科搭配使用，二者協(xié)同可起到活血行氣、散瘀止痛的功效，尤其在月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、跌打損傷、脊柱退行性相關(guān)疾病中使用廣泛，如七制香附丸、杜仲壯骨丸、跌打損傷丸等成藥或方劑中都含有這2種藥物的搭配組合。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)理念和技術(shù)，從“川芎-延胡索”藥對中篩選出58個活性成分，預測相應(yīng)靶點220個。通過分析以這些活性成分和靶點構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型，發(fā)現(xiàn)連接度前3名的化合物為槲皮素（quercetin）、異紫堇杷明（Isocorypalmine）、（S）-金黃紫堇堿[（S）-Scoulerine]。其中槲皮素作為屬于一種天然的黃酮類化合物，在我們?nèi)粘Ｊ澄镏衼碓捶浅ＸS富，大量研究表明具有廣泛的藥理學作用，如抗氧化、抗病毒、抗炎作用，在基礎(chǔ)研究中可療血管、呼吸、泌尿、代謝、骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[12]。異紫堇杷明（Isocorypalmine）為一種較新發(fā)現(xiàn)的生物堿[13]，它與多巴胺D1受體有很高的親和力[K（i）=83 nM][14]，能作為D1部分激動劑和D2拮抗劑產(chǎn)生體內(nèi)效應(yīng)，可能是治療可卡因成癮的一種有前途的藥物[15-16]。（S）-金黃紫堇堿屬于異喹啉類生物堿，有研究表明，它對NMDA受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK-801）誘發(fā)的精神分裂癥的陽性癥狀、陰性癥狀以及認知障礙均有改善作用，而且在抗精神分裂癥的有效劑量下并不引起木僵等錐體外系不良反應(yīng)，提示金黃紫堇堿具有成為新型抗精神病藥的潛力，值得進一步深入研究[17]。網(wǎng)絡(luò)中連接度排名前三的靶點為PTGS2、PTGS1和SCN5A。PTGS中文名為前列腺素過氧化物合酶，又稱環(huán)氧化酶，是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，PTGS有2種同工酶：一種是組成型PTGS1，另一種是誘導型PTGS2，其中靶點PTGS2被報道參與炎性反應(yīng)、細胞凋亡[18]、癌癥[19]等多種病理過程。PGTS1蛋白可促進腫瘤進展過程中的細胞增殖，它的選擇性剪接可導致多種轉(zhuǎn)錄變異[20]。SCN5A是一個完整的膜蛋白和抗四環(huán)素電壓門控鈉通道亞基。這種蛋白主要存在于心肌中，負責心電圖中動作電位的初始上升。該基因缺陷是長QT綜合征3型（LQT3）的病因之一，該基因還與心力衰竭有密切的關(guān)系[21]。上述活性成分和靶點可能在“川芎-延胡索”藥對中發(fā)揮比較關(guān)鍵的作用。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示“川芎-延胡索”藥對的靶點間存在著復雜的交互關(guān)系，而不是獨立的發(fā)揮作用，網(wǎng)絡(luò)中共有212個節(jié)點，3 762條邊，經(jīng)過計算后發(fā)現(xiàn)VEGFA、TP53、TNF、PTGS2、MMP9、MAPK1、JUN、IL6、CASP3、AKT1等可能是“川芎-延胡索”藥對發(fā)揮作用的主要靶蛋白靶點。

通過GO富集分析可知，“川芎-延胡索”藥對的靶基因主要富集在調(diào)控細胞增殖、有機物應(yīng)答、細胞內(nèi)信號級聯(lián)、調(diào)調(diào)控細胞凋亡、控細胞死亡、正向調(diào)控分子功能、正向調(diào)控催化活性、內(nèi)源性刺激應(yīng)答、傷害應(yīng)答、激素刺激應(yīng)答等，這與文獻報道較為吻合說明預測靶點的準確性，為進一步深入闡釋“川芎-延胡索”藥理作用機制提供依據(jù)。此外，“川芎-延胡索”藥對富集較多的靶點還有調(diào)控傳遞神經(jīng)沖動、突觸傳導、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，這些相似的生物學過程可能是“川芎-延胡索”藥對治療痛經(jīng)及脊柱相關(guān)疾病的有關(guān)因素，值得進一步的研究。

KEGG通路分析篩選后共得到了24條信號通路，其中涉及癌癥相關(guān)信號通路的共12條，分別是癌癥相關(guān)通路、前列腺癌、胰腺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、慢性粒細胞白血病、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病。郭秀偉等報道川芎聯(lián)合順鉑組可以通過抑制HIF-1α的表達從而抑制肺癌干細胞樣細胞荷瘤裸鼠腫瘤組織的增殖和復發(fā)[22]。汝濤等發(fā)現(xiàn)川芎可以通過阻滯胰腺癌HS766T細胞G0/G1期，抑制細胞增殖并通過增加合成期細胞百分比促進細胞凋亡的產(chǎn)生，在體外產(chǎn)生抑制胰腺癌HS 766T細胞的增殖的作用[23]。Xu D等[24]發(fā)現(xiàn)川芎嗪通過上調(diào)miR-211從而進一步調(diào)控PI3K/AKT和mTOR信號通路的激活，抑制成髓細胞瘤生長、遷移和侵襲。Gao JL等[25]研究發(fā)現(xiàn)延胡索和莪術(shù)組方可明顯降低腫瘤活性。因此推斷從中醫(yī)活血化瘀方向研究腫瘤的治療具有一定的前景。涉及信號傳導相關(guān)的通路有5條，分別是神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、VEGF信號通路，這些信號通路參與細胞的增殖、分化、細胞運動、遷移等多種生物功能，還與神經(jīng)信號傳導、血管的生成有關(guān)。涉及免疫相關(guān)信號通路有3條分別是TOLL樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、NOD樣受體信號通路，參與機體的免疫調(diào)節(jié)功能。涉及細胞通訊相關(guān)通路有2條分別是黏著斑通路、間隙連接通路。涉及細胞生長和死亡相關(guān)通路有2條分別是凋亡相關(guān)通路、p53信號通路。

綜上所述，本研究以臨床常用藥對“川芎-延胡索”藥對為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)理念和方法分析“川芎-延胡索”藥對所含的有效成分、作用靶點、生物學過程及相關(guān)通路，并構(gòu)建了化合物靶點網(wǎng)絡(luò)及通路氣泡圖以解釋二者的協(xié)同作用機制。研究表明此藥對涉及多種信號通路和生物過程，體現(xiàn)了“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點，上述研究結(jié)果與文獻報道基本一致，為進一步深入研究“川芎-延胡索”藥理作用奠定基礎(chǔ)。

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（2019-05-07收稿 責任編輯：王明）