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        豬繁殖與呼吸綜合征類NADC30與HP-PRRSV毒株RT-PCR鑒別方法的建立與應(yīng)用

        2019-09-10 07:22:44徐雷趙軍楊曉宇殷鑫歡張繼宗朱玲
        江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 2019年1期
        關(guān)鍵詞:毒株流產(chǎn)引物

        徐雷 趙軍 楊曉宇 殷鑫歡 張繼宗 朱玲

        摘要:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRsv)是一種能夠引起大面積呼吸道疾病并快速傳播,導(dǎo)致母豬流產(chǎn)和仔豬死亡的RNA病毒,其特性為變異快,存在毒株間的重組。因此,病原的快速檢測和鑒定對于該病的防控十分重要。本試驗建立了一種能夠區(qū)分類高致病豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADc30與HP-PRRsv毒株的檢測方法,根據(jù)nsp2基因的高變區(qū)的比對結(jié)果,選擇其保守序列,設(shè)計一對檢測引物,類NADc30擴增片段大小為334 bp,HP-PRRsv毒株擴增片段大小為514bp,通過優(yōu)化反應(yīng)條件,最終建立了一種一對引物就可以區(qū)分檢測類NADc30與HP-PRRsv毒株的RT-PcR檢測方法。應(yīng)用本試驗所建立的RT-PcR方法對2017年12月至2018年2月采至四川多地區(qū)的疑似PRRsv感染發(fā)病的46份肺臟進行檢測。結(jié)果顯示,類NADc30檢出率為32.6%,高于HP-PRRsv毒株的檢出率(10.9%)。該方法的建立,為類NADc30和HP-PRRsv毒株的快速鑒別診斷提供了方法,具有重要意義。

        關(guān)鍵詞:

        豬繁殖與呼吸綜合征;類NADc30;HP-PRRsv;鑒別診斷;RT-PcR

        中圖分類號:s828 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1000-4440(2019)01-0109-05

        豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于動脈炎病毒科,有囊膜,是單股正鏈RNA病毒,基因組約長13~15kb。自1987年被首次報道時就一直是影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的呼吸道疾病和繁殖障礙的傳染性疾病,1996年郭寶清等首次從流產(chǎn)胎兒中分離出PRRSV,證實中國成為了PRRSV流行區(qū)域,隨后暴發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征,然后發(fā)展成為高致病豬繁殖與呼吸綜合征(Highly pathogenic porcine repro-ductive and respiratory svn&ome.HP-PRRS).并且逐步向全國蔓延。在2008年,美國暴發(fā)豬呼吸道疾病,并分離出病毒命名為NADC30,2013年,在中國河南首次發(fā)現(xiàn)了類NADC30,在2017年四川大面積暴發(fā)母豬流產(chǎn),斷奶仔豬表現(xiàn)為呼吸困難,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)病原是類NADC30。仔豬和育肥豬伴隨有間質(zhì)性肺炎,出血性肺炎等癥狀,PRRSV通常導(dǎo)致免疫功能障礙,伴隨細(xì)菌感染,可能會有胸腔積液并形成絨毛心,病死率較高,母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)。由于PRRSV會發(fā)生自身重組和缺失,造成近年來在中國流行毒株不斷發(fā)生變異,并形成很多新基因亞型和新型毒株,加之外來毒株傳入中國,雖然根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀能夠確定感染PRRSV,但是HP-PRRSV毒株的疫苗對類NADC30交叉保護效果差,因此,病毒的鑒別對該病的控制非常重要。

        PCR方法是鑒定PRRSV毒株的有效方法,目前已建立了類NADC30和HP-PRRSV毒株單一的PCR檢測方法。在實際生產(chǎn)中,一旦發(fā)現(xiàn)2個毒株同時感染或者單一毒株感染時,使用單一PCR對其進行檢測就會出現(xiàn)操作麻煩,時間長,成本增加等缺點。因此,建立一種一對引物即可區(qū)分HP-PRRSV毒株和類NDAC30的RT-PCR將使診斷更加方便,本研究擬通過設(shè)計一對特異性引物,能夠以類NADC30和HP-PRRSV毒株為模板,擴增出不同條帶,能夠快速有效地對類NADC30和HP-PRRSV進行鑒別檢測。

        1材料與方法

        1.1病毒和病料

        類NADC30(NADC30-1ike virus)、HP-PRRSV、豬瘟病毒(Classical swine fever,CSFV)、細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、日本乙型腦炎病毒(Jap-anese encephalitis virus,JEV)、輪狀病毒(Rotavirus,RV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心保存。病料(肺)采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)?;B(yǎng)豬場。

        1.2主要試劑

        2xTaq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司:RNAiso Plus、Prime-Script RT Kit購自大連寶生物工程有限公司。

        1.3引物設(shè)計與合成

        根據(jù)GenBank中已發(fā)表的類NADC30毒株基因組序列(JN654459.1、KF724397.1、KF724398.1等)和HP-PRRSV株基因組序列(EUl06888.1、EU236259.1、EU236259.1等),通過MEGA對比,選取nsp2的保守序列,運用Primier premier5.0設(shè)計引物,并采用NCBI網(wǎng)站上的blast方法,進行比對其特異性,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。

        2.4重復(fù)性試驗

        用所建立的RT-PCR鑒別方法對同一陽性模板進行檢測,結(jié)果顯示模板6次擴增出來的目的條帶完全相同(圖5),證明該方法具有很好的重復(fù)性。

        2.5臨床應(yīng)用

        采用本試驗建立的方法對采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等地的46份流產(chǎn)胎兒肺臟進行檢測。顯示檢出類NADC30陽性15份,陽性率32.6%。檢出HP-PRRSV陽性5份,陽性率10.9%。與孫英峰等。建立的能夠區(qū)分HP-PRRSV、類NADC30的PCR檢測方法相比較,類NADC30檢測的一致性為93.3%(14/15),HP-PRRSV檢測的一致性為100%(5/5)。

        3討論

        PRRSV作為能夠引起呼吸和繁殖方面疾病的病毒,可通過呼吸道傳播,豬的規(guī)?;B(yǎng)殖模式為PRRS大規(guī)模爆發(fā)提供了潛在條件,一旦暴發(fā),傳播迅速,導(dǎo)致大量仔豬死亡,會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。PRRSV滅活疫苗存在安全性和免疫效果差的問題,且不能引起細(xì)胞免疫,為避免PRRS發(fā)生,規(guī)?;i場普遍使用PRRSV弱毒疫苗對豬群進行防控,但是目前PRRSV弱毒活疫苗存在安全性問題,弱毒活疫苗對PRRSV有較好的防控效果,但是存在毒力返強,導(dǎo)致豬場發(fā)病;雖然同源毒株制成的疫苗可以形成交叉保護,但是不同毒株所制成的疫苗則不行:親緣性高的毒株容易在豬體內(nèi)進行基因重組,形成重組毒株。中國西南地區(qū)流行的主要是HP-PRRSV,但是在2017年下半年,HP-PRRSV檢出率低,但是出現(xiàn)持續(xù)性暴發(fā)母豬流產(chǎn),保育豬存在呼吸道疾病等問題,但是沒有檢測出圓環(huán)病毒和偽狂犬病毒。HP-PRRSV和類NADC30混合感染時,單一的PCR方法鑒別HP-PRRSV與類NADC30,耗時,操作步驟多,成本增加。

        由于國內(nèi)流行毒株的重組或缺失變異以及毒株的多樣性,導(dǎo)致呼吸道疾病多樣化,一旦發(fā)病,防控困難,將會給養(yǎng)殖場帶來極大的損失。因此,對當(dāng)前的豬繁殖與呼吸綜合征進行臨床監(jiān)測和分子流行病學(xué)調(diào)查十分必要,及時了解當(dāng)前流行的毒株,以進行實時監(jiān)控,這樣才能夠?qū)σ咔檫M行及時的防控。本研究根據(jù)最近四川部分地區(qū)的流行毒株建立類NADC30和HP-PRRSV毒株的RT-PCR鑒別方法,可以快速有效鑒別類NADC30和HP-PRRSV,其方便、靈敏、準(zhǔn)確、省時等優(yōu)點,對于臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

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