葉妮 馬金昀 程曉東

摘要 目的：觀察黃芪多糖（APS）對C17.2神經(jīng)干細胞體外定向分化的調(diào)控作用。方法：建立C17.2神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)體系及分化模型，設(shè)置APS干預(yù)組及PBS對照組。誘導(dǎo)分化4 d后，通過細胞免疫熒光染色的方法檢測2組細胞中神經(jīng)干細胞的標志性蛋白巢蛋白（Nestin）、星形膠質(zhì)細胞的標志性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、少突膠質(zhì)細胞的標志性蛋白髓鞘堿性蛋白（MBP）及神經(jīng)元的標志性蛋白神經(jīng)元特異性核心抗原（NeuN）的表達水平。結(jié)果：與PBS對照組比較，APS干預(yù)組細胞的Nestin及GFAP蛋白表達水平明顯下調(diào)，MBP及NeuN蛋白表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。APS下調(diào)了分化模型中的細胞Nestin蛋白的表達水平;APS下調(diào)了GFAP蛋白的表達水平，上調(diào)了MBP及NeuN蛋白的表達水平。結(jié)論：APS可抑制C17.2神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞的定向分化，促進向少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元的定向分化，APS可抑制C17.2神經(jīng)干細胞的干性維持，促進其進入分化狀態(tài)，有可能成為治療神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物。

關(guān)鍵詞 神經(jīng)干細胞;定向分化;黃芪多糖;少突膠質(zhì)細胞;神經(jīng)元;星形膠質(zhì)細胞;神經(jīng)退行性疾病;體外研究

Abstract Objective：To observe regulatory effects of Astragalus Polysaccharide（APS）on directional differentiation of C17.2 neural stem cells in vitro.Methods：Cultivation system and differentiation model of C17.2 neural stem cells were established in vitro.APS intervention group and PBS control group were set up.Immunofluorescence staining was used to detect expression levels of Nestin，GFAP，MBP and NeuN，the simbolic marker proteins of neural stem cells，astrocytes，oligodendrocytes and neurons，so as to explore the regulatory effects of APS on directional differentiation of C17.2 neural stem cells.Results：Compared with the PBS control group，the expression levels of Nestin and GFAP proteins in the APS intervention group were down-regulated while the expression levels of MBP and NeuN proteins were up-regulated.The differences were statistically significant（P<0.05）.APS down-regulated the expression level of Nestin protein in the differentiation model，which meant it could inhibit the stemness maintenance of C17.2 neural stem cells and lead them to enter the differentiation state.APS down-regulated the expression level of GFAP protein，and up-regulated the expression levels of MBP and NeuN proteins，which meant it could promote C17.2 neural stem cells to differentiate into oligodendrocytes and neurons directionally，and inhibit them to differentiate into astrocytes.Conclusion：APS can effectively regulate the directional differentiation of C17.2 neural stem cells in vitro，which suggests that it might be a potential drug for the treatment of neurodegenerative diseases.

Key Words Neural stem cells; Directional differentiation; Astragalus polysaccharides; Oligodendrocytes; Neurons; Astrocytes; Neurodegenerative diseases; Study in vitro

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.012

神經(jīng)干細胞（Neural Stem Cell，NSC）是指一類可以自我更新，主要分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元細胞，廣泛存在于胚胎及成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[1]。由于具有多向分化的潛能，神經(jīng)干細胞自1992年發(fā)現(xiàn)以來便備受關(guān)注，有望成為治療神經(jīng)退行性疾?。∟eurodegenerative Diseases，ND）的種子細胞[2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在體外自然分化狀態(tài)下，神經(jīng)干細胞絕大多數(shù)分化為星形膠質(zhì)細胞，分化為神經(jīng)元的比例次之，最小一部分分化為少突膠質(zhì)細胞[3]。在ND的動物模型體內(nèi)移植研究中也發(fā)現(xiàn)，移植的神經(jīng)干細胞往往不能有效分化為目標細胞群[4]。因此，適當調(diào)控神經(jīng)干細胞的定向分化，促進目標細胞的再生，或可成為治療ND的有效手段。C17.2神經(jīng)干細胞是美國哈佛大學(xué)Snyder教授將V-myc基因轉(zhuǎn)入到小鼠小腦原代神經(jīng)干細胞中，而構(gòu)建的永生化細胞系。它具有神經(jīng)干細胞的所有特征，是用來研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞再生的理想工具[5]。巢蛋白（Nestin）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）、髓鞘堿性蛋白（Myelin Basic Protein，MBP）、神經(jīng)元特異性核心抗原（Neuron Specific Nuclear Protein，NeuN）分別是公認的神經(jīng)干細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元的標志性蛋白[6-8]。本研究通過檢測Nestin、GFAP、MBP、NeuN蛋白的表達水平，探討中藥黃芪的主要活性成分——黃芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS）對C17.2神經(jīng)干細胞體外定向分化的調(diào)控作用。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 C17.2神經(jīng)干細胞由上海交通大學(xué)納米生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供。

1.1.2 藥物 黃芪多糖（UV≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。黃芪多糖粉末用PBS緩沖液配成5 mg/mL母液，0.22 μm濾器過濾后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清、青鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國HyClone公司;一抗：Nestin小鼠單抗（ab11306）、GFAP山羊多抗（ab53554）、MBP兔多抗（ab40390）、NeuN兔多抗（ab128886）購自英國Abcam公司;熒光二抗：山羊抗小鼠IgG-Cy3（115-165-003）、兔抗山羊IgG-Cy3（305-165-003）、山羊抗兔IgG-Cy3（111-165-003）購自美國Jackson公司;多聚甲醛、Triton-X、牛血清白蛋白（BSA）、DAPI水溶液、抗淬滅封片劑等為國產(chǎn)。熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實驗設(shè)置黃芪多糖干預(yù)組及PBS對照組。參照Li等[9]的方法建立C17.2神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)體系及分化模型。增殖培養(yǎng)液：84%DMEM高糖+10%胎牛血清+5%馬血清+1%雙抗。分化培養(yǎng)液：98.5%DMEM高糖+0.5%胎牛血清+1%雙抗。培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2。體外培養(yǎng)體系的建立：使用增殖培養(yǎng)液以2×103/cm2的密度將細胞接種至培養(yǎng)瓶，待細胞長到底部80% ～90%融合度時按1∶ 5比例傳代。分化模型的建立：取體外培養(yǎng)體系中處于對數(shù)生長期的細胞，使用增殖培養(yǎng)液將細胞以2×103/cm2的密度接種至鋪有專用細胞爬片的6孔板，培養(yǎng)24 h后吸棄原培養(yǎng)液，換分化培養(yǎng)液。每2天換新的分化培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 d以建立分化模型。

1.2.2 給藥方法 依據(jù)文獻查閱和本實驗室的前期研究結(jié)果，將黃芪多糖的作用濃度設(shè)定為0.1 mg/mL[10-11]。黃芪多糖干預(yù)組使用分化培養(yǎng)液將黃芪多糖母液稀釋至0.1 mg/mL;PBS對照組在分化培養(yǎng)液中加入與黃芪多糖母液等體積的PBS。誘導(dǎo)分化4 d后，進行細胞免疫熒光染色，檢測Nestin、GFAP、MBP及NeuN蛋白的表達水平，該實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3 檢測指標與方法 取體外培養(yǎng)體系中C17.2神經(jīng)干細胞，使用增殖培養(yǎng)液將細胞以2×103/cm2的密度接種至鋪有專用細胞爬片的6孔板。培養(yǎng)48 h后，進行細胞免疫熒光染色檢測神經(jīng)干細胞的標志性蛋白Nestin、星形膠質(zhì)細胞的標志性蛋白GFAP、少突膠質(zhì)細胞的標志性蛋白MBP及神經(jīng)元的標志性蛋白NeuN的表達水平，以鑒定該細胞處于未分化狀態(tài)。

取出6孔板，吸棄培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗1次。4%多聚甲醛室溫固定30 min后，PBS清洗3次。0.3%Triton-X破膜10 min，PBS清洗3次。1%BSA封閉1 h，吸棄BSA。加入95%PBS+5%胎牛血清稀釋的一抗工作液，稀釋比例：Nestin（1∶ 100）、GFAP（1∶ 200）、MBP（1∶ 180）、NeuN（1∶ 200），4 ℃孵育過夜。PBS替代一抗工作液作為陰性對照。次日早晨吸棄一抗工作液，PBS清洗3次，加入95%PBS+5%胎牛血清稀釋的二抗工作液，稀釋比例均為1∶ 1 000，室溫避光孵育1 h。吸棄二抗工作液，PBS清洗3次后，加入DAPI水溶液，室溫避光孵育10 min，PBS清洗3次。將細胞爬片從6孔板中取出，滴加少量抗淬滅封片劑后蓋于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。每張細胞爬片隨機取5個無重疊的高倍鏡（200倍）視野拍照，記錄陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算陽性細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，先行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，服從正態(tài)分布且方差齊者，采用獨立樣本t檢驗;不服從正態(tài)分布或方差不齊者，采用Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞鑒定 經(jīng)細胞免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，處于體外培養(yǎng)體系的C17.2神經(jīng)干細胞幾乎全部表達Nestin蛋白，占（98.62±3.51）%，極少表達GFAP、MBP、NeuN蛋白，表明此時C17.2細胞處于未分化狀態(tài)，可以用于下游分化實驗。見圖1。

2.2 黃芪多糖對C17.2神經(jīng)干細胞干性維持的影響 經(jīng)細胞免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，分化模型中的PBS對照組細胞表達的Nestin蛋白水平較在體外培養(yǎng)體系有所下調(diào)。分化模型中的黃芪多糖干預(yù)組細胞表達的Nestin蛋白水平較PBS對照組進一步下調(diào)，PBS對照組中表達Nestin蛋白的細胞占（19.38±6.50）%，黃芪多糖干預(yù)組中表達Nestin蛋白的細胞占（11.09±4.32）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。黃芪多糖下調(diào)了分化模型中的細胞表達Nestin蛋白的水平。見圖2。

2.3 黃芪多糖對C17.2神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞定向分化的影響 經(jīng)細胞免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，分化模型中的黃芪多糖干預(yù)組細胞表達的GFAP蛋白水平較PBS對照組明顯下調(diào)，PBS對照組中表達GFAP蛋白的細胞占（43.22±12.21）%，黃芪多糖干預(yù)組中表達GFAP蛋白的細胞占（8.00±2.72）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。黃芪多糖下調(diào)了分化模型中的細胞表達GFAP蛋白的水平。見圖3。

2.4 黃芪多糖對C17.2神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞定向分化的影響 經(jīng)細胞免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，分化模型中的黃芪多糖干預(yù)組細胞表達的MBP蛋白水平較PBS對照組明顯上調(diào)，PBS對照組中表達MBP蛋白的細胞占（6.55±3.26）%，黃芪多糖干預(yù)組中表達MBP蛋白的細胞占（28.73±8.95）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。黃芪多糖上調(diào)了分化模型中的細胞表達MBP蛋白的水平。見圖4。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

2.5 黃芪多糖對C17.2神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元定向分化的影響 經(jīng)細胞免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，分化模型中的黃芪多糖干預(yù)組細胞表達的NeuN蛋白水平較PBS對照組明顯上調(diào)，PBS對照組中表達NeuN蛋白的細胞占（7.79±3.29）%，黃芪多糖干預(yù)組中表達NeuN蛋白的細胞占（16.36±5.02）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。黃芪多糖上調(diào)了分化模型中的細胞表達NeuN蛋白的水平。見圖5。

3 討論

神經(jīng)退行性疾病（Neurodegenerative Diseases，ND）是指一類由慢性進行性中樞神經(jīng)組織退行性變而引起的疾病，包括以神經(jīng)元變性、死亡為特征的阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）、帕金森病（Parkinson Disease，PD）、腦卒中（Stroke）等，以及以少突膠質(zhì)細胞死亡為特征的多發(fā)性硬化（Multiple Sclerosis，MS）、脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）、佩梅?。≒elizaeus-Merzbacher Disease，PMD）等[12]。目前，臨床上治療ND的藥物僅可以有限地延緩神經(jīng)退變進程，不能有效地修復(fù)死亡的細胞[13]。如何在不同病理特征的ND中，獲得大量缺失的細胞，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。近年的研究發(fā)現(xiàn)，ND中均伴有星形膠質(zhì)細胞的異常激活和增殖，它們可分泌大量的炎性反應(yīng)遞質(zhì)，促進疾病的發(fā)展，以及形成致密的膠質(zhì)瘢痕，阻礙抗炎細胞因子修復(fù)病灶[14]。適度地抑制星形膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生，促進神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細胞的再生，便可以有效地治療ND。20世紀90年代，發(fā)育生物學(xué)證明，星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元均由神經(jīng)干細胞發(fā)育分化而來[2]。在成年健康腦中，神經(jīng)干細胞處于相對靜止的狀態(tài);在疾病狀態(tài)下，神經(jīng)干細胞被激活，根據(jù)微環(huán)境的誘導(dǎo)而增殖、遷移、分化為缺失的細胞，以修復(fù)病灶[15]。在ND動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，此時激活的神經(jīng)干細胞大多分化為星形膠質(zhì)細胞，分化為少突膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元的比例很低，這與體外研究的結(jié)論一致[3-4]。本研究也發(fā)現(xiàn)，體外低血清培養(yǎng)可誘導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細胞自然分化。因此，適度調(diào)控神經(jīng)干細胞的定向分化，便可促進少突膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元的再生，同時又可抑制星形膠質(zhì)細胞的過度增殖，這已成為治療ND的新思路。

黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性成分之一，也是主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的成分[16]。本實驗室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有明顯的神經(jīng)保護作用，在體內(nèi)可有效緩解MS的動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）小鼠的神經(jīng)功能障礙，抑制脊髓脫髓鞘，抑制外周和中樞免疫系統(tǒng)中過度的炎性反應(yīng);在體外可有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的活化，抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)的分泌[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以促進大鼠原代神經(jīng)干細胞的增殖，并保護其免受缺氧誘導(dǎo)的細胞損傷[17-18]。在PD、腦缺血、腦出血以及缺血后再灌注的動物模型研究中，黃芪多糖被證明還有抑制神經(jīng)元凋亡的作用[19-22]。然而，其對于神經(jīng)干細胞的定向分化是否具有調(diào)控作用，能否促進少突膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元的再生，至今仍不清楚。研究采用Nestin、GFAP、MBP、NeuN分別作為神經(jīng)干細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元的標志性蛋白，通過細胞免疫熒光染色的方法檢測其表達水平，探討黃芪多糖對C17.2神經(jīng)干細胞體外定向分化的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在0.1 mg/mL的濃度下可有效調(diào)控C17.2神經(jīng)干細胞的定向分化。黃芪多糖干預(yù)后，分化模型中的細胞表達Nestin蛋白水平明顯下調(diào)，表明此時神經(jīng)干細胞已不能維持其產(chǎn)生與親代細胞相同的子代細胞的能力，失去了干細胞的特征，而進入分化狀態(tài)。已分化的細胞中有（28.73±8.95）%分化為少突膠質(zhì)細胞，（16.36±5.02）%分化為神經(jīng)元，分化為星形膠質(zhì)細胞的比例下降至（8.00±2.72）%，與PBS對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表明黃芪多糖可以抑制C17.2神經(jīng)干細胞的干性維持，促進其進入分化狀態(tài)，促進少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的再生，抑制星形膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生。

綜合分析ND的發(fā)病機制、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元再生的相關(guān)分子信號以及黃芪多糖的作用特點，以下機制可能參與了黃芪多糖調(diào)控神經(jīng)干細胞的定向分化過程。1）抗氧化應(yīng)激。ND患者均伴有明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化還原失衡現(xiàn)象，而少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元對活性氧物質(zhì)（Reactive Oxygen Species，ROS）、活性氮物質(zhì)（Reactive Nitrogen Species，RNS）及各級代謝產(chǎn)物尤為敏感，極易引起死亡和變性[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在四氯化碳誘導(dǎo)的肝炎大鼠模型中，有明顯的抗氧化應(yīng)激作用[24]。因此，抗氧化應(yīng)激可能是其發(fā)揮調(diào)控作用的機制之一。2）調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過度的免疫反應(yīng)是ND的另一病理特點，例如在AD和MS患者腦中都存在神經(jīng)小膠質(zhì)細胞、T細胞的異常激活，它們可形成強大的免疫級聯(lián)，互相活化，分泌大量的炎性反應(yīng)遞質(zhì)和炎性趨化因子，引發(fā)少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的大面積凋亡[25]。黃芪多糖已被證明有顯著的調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫反應(yīng)的作用，例如它可以有效抑制脂多糖誘導(dǎo)神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的活化，抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、核因子-κB的分泌[11，26]。因此，調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫反應(yīng)或成為黃芪多糖調(diào)控神經(jīng)干細胞定向分化的潛在機制之一。3）調(diào)控神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的信號通路。有研究證明，TGF-β/Smad、Sonic Hedgehog、Notch、Wnt/β-catenin、MAPK等是參與胚胎時期神經(jīng)組織發(fā)育的主要信號通路[27]。具體地，TGF-β/Smad等通路主要影響星形膠質(zhì)細胞的發(fā)育，Sonic Hedgehog等通路主要影響少突膠質(zhì)細胞的生長，Wnt/β-catenin等通路主要影響神經(jīng)元的生長。黃芪多糖有可能是通過調(diào)節(jié)這些信號通路的活性，從而促進少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的再生，抑制了星形膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

本研究通過體外實驗，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可有效地調(diào)控C17.2神經(jīng)干細胞的定向分化，有可能成為治療ND的潛在藥物。在此基礎(chǔ)上，本研究將進一步探討黃芪多糖調(diào)控神經(jīng)干細胞定向分化的細胞分子機制，以及完善動物實驗，以期能為臨床上治療ND提供新的方法。

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（2018-09-06收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C