吳誠旭 章雙 黎銘 張海濤 史黎黎

摘要：【目的】分析WDS基因在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）各組織中的表達情況及應對不同病原感染時的表達變化，以揭示WDS在動物體除生殖外其他生理活動中的功能作用?！痉椒ā坎捎肦ACE-PCR克隆凡納濱對蝦WDS基因（LvWDS）cDNA序列，利用在線生物信息學軟件進行序列分析，并以實時熒光定量PCR分析LvWDS基因在凡納濱對蝦不同組織中的表達情況及不同病原感染后的表達變化?！窘Y果】LvWDS基因（GenBank登錄號MH330316）cDNA序列全長1880 bp，其中，開放閱讀框（ORF）978 bp，5'端非編碼區(qū)（5'UTR）183 bp，3'端非編碼區(qū)（3'UTR）719 bp，編碼325個氨基酸。LvWDS氨基酸序列含有7個WD40重復序列（保守結構域），與擬穴青蟹（Scylla paramamosain）WDS氨基酸序列的相似性最高，為99%，基于WDS氨基酸序列相似性構建的系統發(fā)育進化樹也顯示LvWDS與擬穴青蟹WDS的親緣關系最近。LvWDS基因在凡納濱對蝦精囊中的相對表達量最高，在血細胞、鰓和腸道等免疫組織中處于較高表達水平，在肌肉組織中的表達水平最低。經白斑綜合癥病毒（WSSV）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染后，凡納濱對蝦血細胞、鰓和腸道組織中LvWDS基因的相對表達量均不同程度發(fā)生變化?！窘Y論】WDS進化十分保守，其在不同物種中的功能穩(wěn)定。LvWDS除了在凡納濱對蝦生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用外，可能還與免疫相關，在凡納濱對蝦抗病免疫中發(fā)揮作用。

關鍵詞： 凡納濱對蝦;WD重復蛋白;WDS基因;組織表達;白斑綜合癥病毒（WSSV）;副溶血弧菌

中圖分類號： S945.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0165-08

0 引言

【研究意義】我國是世界對蝦養(yǎng)殖第一大國，凡納濱對蝦是最主要的養(yǎng)殖品種（農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，2016），而病害是制約對蝦養(yǎng)殖產業(yè)健康發(fā)展的瓶頸（周井娟，2016）。在對蝦病害中，以白斑綜合癥（White spot syndrome，WSS）的危害最嚴重（曹煜成等，2018），弧菌病則是對蝦養(yǎng)殖過程中難以回避的問題（Lightner et al.，2005;呂莉等，2018;明磊等，2018）。對蝦發(fā)病受自身因素、病原侵入及外部環(huán)境3個方面的影響，其中增強對蝦自身免疫力能從根本上起到防治病害的作用（Thitamadee et al.，2016）。因此，開展對蝦先天性免疫防御機制研究，對尋求有效的對蝦病害防治方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】對蝦的先天性免疫系統可分為細胞免疫和體液免疫，其中體液免疫的主體是血淋巴中一些天然或誘導產生的生物活性物質（Xu et al.，2014），主要包括各種酶類（酚氧化酶、溶菌酶、過氧化氫酶等）、免疫因子（凝集素、抗菌肽等）和調節(jié)因子等（Lai et al.，2005;Burge et al.，2007;Zhao et al.，2009;Zanjani et al.，2018），并通過Toll、IMD及JAK/STAT信號通路等多種免疫途徑傳遞信號，最終在應對病原感染過程中發(fā)揮重要作用（Li and Xiang，2013）。但總體而言，有關對蝦先天性免疫的認識還有待進一步探究。WD重復蛋白是真核生物中的一個蛋白大家族，由多種結構類似、功能各異的蛋白組成，在細胞信號轉導、蛋白運輸、細胞骨架裝配、染色體修飾及轉錄調節(jié)等方面發(fā)揮重要作用（Villanueva et al.，2016），其基因突變與Allgrove綜合癥、Cockayne綜合癥等多種人類疾病相關（Li and Roberts，2001）。WD重復蛋白是由4～8個高度保守的WD重復基元（也稱WD40重復）組成，WD40重復的N端一般含有一個甘氨酸—組氨酸（GH）二肽序列，C端則含有一個色氨酸—天冬氨酸（WD）二肽序列（Coronin，2008）。WDS是WD重復蛋白家族的新成員，因包含7個WD重復又名WD seven，最早從黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）飽和誘變體的致死互補群zw8中分離獲得（Hollmann et al.，2002），后續(xù)的相關研究也主要集中在昆蟲類動物，至今尚無脊椎動物WDS基因的相關報道。在果蠅卵子發(fā)生過程中，WDS基因的缺失會導致細胞死亡（Hollmann et al.，2002）;在柞蠶（Antherea pernyi）中，WDS基因在脂肪體和馬氏管中的表達量最高，且卵巢中的表達量高于精巢，與在家蠶（Bombyx mori）中的表達規(guī)律一致（Li et al.，2011）;在甲殼類動物擬穴青蟹（Scylla paramamosain）中，WDS基因在各組織中均有表達，但以在卵巢中的表達量較高（高潔，2013）。【本研究切入點】綜上所述，WDS在動物體的生殖發(fā)育過程尤其是卵子發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用，但至今有關凡納濱對蝦WDS基因的功能研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】在克隆凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）WDS基因（LvWDS）的基礎上，進一步分析其在凡納濱對蝦各組織中的表達情況及應對不同病原感染時的表達變化，旨在揭示WDS在動物體除生殖外其他生理活動的功能作用。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

凡納濱對蝦（8～10 g/尾）購于廣東恒興集團有限公司，試驗前暫養(yǎng)7 d以適應實驗室環(huán)境。攜帶白斑綜合癥病毒（WSSV）的凡納濱對蝦及副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）由農業(yè)農村部華南水產與畜禽飼料重點實驗室保存提供;RACE模板制備試劑盒購自美國Clontech公司;RNA提取試劑盒和克隆片段膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司;cDNA逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1. 2 LvWDS基因cDNA克隆及序列分析

LvWDS基因的部分序列信息來源于凡納濱對蝦轉錄組數據，同時采用Primer Premer 5.0設計5'RACE和3'RACE特異性引物（表1），5'端和3'端RACE-PCR擴增分別采用特異性引物WDS-5R和WDS-3R與通用引物NUP配對，具體反應體系和擴增程序參照黃金鳳等（2017）的研究方法。RACE-PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段進行測序鑒定。

1. 3 LvWDS基因序列生物信息學分析

利用NCBI網站中的BLAST、EditSeq及SMART等在線軟件對LvWDS基因序列進行比對分析，預測其開放閱讀框（ORF）及氨基酸序列，并分析其編碼蛋白功能結構域等相關生物學信息。利用ClustalX對不同物種來源的WDS蛋白序列進行多序列比對，并以MEGA 7.0構建系統發(fā)育進化樹。

1. 4 LvWDS基因在凡納濱對蝦組織中的表達差異分析

隨機挑選暫養(yǎng)7 d后的凡納濱對蝦12尾，4尾一組，分別采集眼柄、肝胰腺、胃、表皮、心臟、血細胞、神經、肌肉、精囊、鰓和腸道等11個組織提取總RNA，反轉錄合成cDNA 模板后用于qPCR定量分析，引物為WDS-qF和WDS-qR，具體操作參照黃金鳳等（2017）的方法。以EF1α基因為內參基因。

1. 5 WSSV和副溶血弧菌感染后LvWDS基因表達差異分析

將凡納濱對蝦分為3組，每組90尾，每組又分成3個平行（10尾）。WSSV懸液制備、副溶血弧菌培養(yǎng)鑒定及人工感染均參照Zhang等（2016）的方法，分別在注射感染后不同時間點（0、4、8、12、24、48和72 h）采集血細胞、腸道和鰓3種組織，每個平行取3尾對蝦的相同組織混合成1個樣品。qPCR定量分析同1.4，并采用 t 檢驗進行LvWDS基因表達差異分析。

2 結果與分析

2. 1 LvWDS基因cDNA全長及其序列分析結果

將RACE-PCR擴增產物拼接即獲得LvWDS基因（GenBank登錄號MH330316），測序結果（圖1）表明，其cDNA全長1880 bp，包括ORF 978 bp、5'端非編碼區(qū)（5'UTR）183 bp和3'端非編碼區(qū)（3'UTR）719 bp，編碼325個氨基酸。SMART分析結果顯示，LvWDS氨基酸序列含有7個WD40保守結構域（圖2），分別位于第25～64、67～106、109～148、151～190、193～233、236～278和281～322位氨基酸殘基。通過對比LvWDS氨基酸序列中的7個WD40重復序列（保守結構域），發(fā)現與其他6個WD40重復序列不同，第7個WD40重復序列在靠近C端有兩個氨基酸殘基插入（圖3）。

2. 2 LvWDS氨基酸多重序列比對分析結果

分析不同物種WDS氨基酸序列間的相似性，結果顯示，LvWDS與所選昆蟲類和甲殼動物類中多個物種WDS氨基酸序列的相似性較高，均超過84%，其中，與擬穴青蟹WDS氨基酸序列的相似性最高，達99%（圖4）。基于WDS氨基酸序列相似性構建的系統發(fā)育進化樹（圖5）也顯示，LvWDS與同為甲殼動物的擬穴青蟹WDS和大型溞WDS聚為一類，且與擬穴青蟹的親緣關系最近。

2. 3 LvWDS基因在凡納濱對蝦不同組織中的表達情況

LvWDS基因在凡納濱對蝦不同組織中的表達情況如圖6所示。LvWDS基因在11種組織中均被檢測到，其中以心臟、血細胞、神經、精囊、鰓及腸道組織中的表達量較高，而在肌肉組織中的表達量最低。經2?△△Ct換算得知，LvWDS基因在精囊中的相對表達量最高，約是肌肉中相對表達量的22.40倍，在鰓組織中的表達量次之（圖7）。

2. 4 WSSV感染對LvWDS基因表達的影響

WSSV感染后，凡納濱對蝦血細胞中LvWDS基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢（圖8-A），在感染后24 h達峰值，約是對照組的3.00倍;感染48 h后開始下降，與對照組無顯著差異（P>0.05，下同）。WSSV感染后8 h內，凡納濱對蝦鰓組織中LvWDS基因的表達水平與對照組無顯著差異;至感染后12 h，LvWDS基因的表達水平較對照組顯著升高（P<0.05，下同）;至感染后24 h達最高值，約是對照組的3.00倍;感染72 h后又降至對照組水平，二者差異不顯著（圖8-B）。在腸道組織中，LvWDS基因的相對表達量在凡納濱對蝦感染WSSV后呈先下降后上升再下降的變化趨勢;感染4 h后，其相對表達量較對照組顯著下降，約是對照組的60%;感染8 h后開始升高，且各檢測時間點均顯著或極顯著（P<0.01，下同）高于對照組，至感染后24 h達最高值，約是對照組的3.50倍（圖8-C）。

2. 5 副溶血弧菌感染對LvWDS基因表達的影響

注射感染副溶血弧菌后，凡納濱對蝦血細胞中LvWDS基因的相對表達量除了感染后12和72 h外，其他檢測時間點均顯著或極顯著高于對照組，以感染后8 h的相對表達量最高，約是對照組的2.10倍（圖9-A）。感染副溶血弧菌后12 h內，凡納濱對蝦鰓組織中LvWDS基因的相對表達量顯著或極顯著低于對照組，但感染24 h后較對照組極顯著升高，至感染后48 h又降至與對照組無顯著差異的表達水平（圖9-B）。在腸道組織中，LvWDS基因的相對表達量在各檢測時間點均顯著或極顯著高于對照組，以感染后4 h的相對表達量最高，約是對照組的3.30倍（圖9-C）。

3 討論

WDS作為新發(fā)現的WD重復蛋白家族成員，主要認為其與動植物的生殖發(fā)育相關。本研究成功從凡納濱對蝦克隆獲得LvWDS基因，其蛋白序列分析發(fā)現，LvWDS具有WDS蛋白的典型特征，包含7個WD40重復序列，與其他物種的同源蛋白一致。目前，在NCBI中能搜索到已注冊且具有ORF全長的WDS基因序列主要有無脊椎動物、植物和真菌三大類，脊椎動物中只能搜索到相關的表達序列標簽（EST）信息。對不同物種間的WDS蛋白氨基酸序列進行多重比對分析，結果發(fā)現各物種間相同位置WD重復基元的氨基酸序列十分保守，同源性較高;在WDS氨基酸序列的最后一個WD40重復序列中，除致倦庫蚊的插入氨基酸為谷氨酸（E）和絲氨酸（S）外，包括黑腹果蠅（Hollmann et al.，2002）和柞蠶（Li et al.，2011）在內的多個物種插入氨基酸均為谷氨酸（E）和天冬酰胺（N），LvWDS氨基酸序列中的插入序列也為E和N。LvWDS與不同物種WDS蛋白的相似性較高，其中與同為甲殼動物擬穴青蟹WDS的相似性高達99%;基于WDS氨基酸序列相似性構建的系統發(fā)育進化樹也顯示，LvWDS與擬穴青蟹WDS的親緣關系最近?？梢?，WDS在進化上十分保守，暗示其在不同物種中的功能穩(wěn)定。

目前，有關WDS基因在動物體不同組織分布的信息不多，僅在果蠅、柞蠶和擬穴青蟹中有相關報道，其中在柞蠶（Li et al.，2011）和擬穴青蟹（高潔，2013）中WDS基因的組織分布信息相對全面。與果蠅、柞蠶和擬穴青蟹WDS基因在生殖相關的組織中表達量最高相一致，LvWDS基因在凡納濱對蝦精囊中的相對表達量最高，提示LvWDS在凡納濱對蝦生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在擬穴青蟹中，除生殖相關組織外，WDS基因在鰓、血細胞和腸道等免疫組織中的表達量較高，而在肝胰腺中的表達量最低（高潔，2013）。同樣，LvWDS基因在凡納濱對蝦的鰓、血細胞和腸道組織中表達量較高，其中在鰓組織中的表達量僅次于精囊，提示LvWDS基因很可能與凡納濱對蝦的免疫相關。與前人的相關研究（Li et al.，2011;高潔，2013）不同，本研究中LvWDS基因在凡納濱對蝦肌肉組織中表達量最低，而在柞蠶和擬穴青蟹肌肉組織中的表達量均處于較高水平，說明在不同物種中WDS基因功能呈多樣性。

在人類生命的信號轉導和疾病防御及其治療上，WD重復蛋白調控機制發(fā)揮著不可或缺的作用（Coronin，2008）。WD重復蛋白之一smu-1在羅氏沼蝦中被干擾后，羅氏沼蝦應對熱誘導能力顯著降低（錢美睿，2013）。同為WD重復家族成員，WDS在動物體中的研究主要集中在生殖功能方面（Hollmann et al.，2002;Li et al.，2011;高潔，2013;Ye et al.，2014）。考慮到WD重復蛋白家族基因功能的多樣性，基于LvWDS基因在凡納濱對蝦免疫組織中的較高表達情況，本研究對凡納濱對蝦應答病原感染時LvWDS基因的表達情況進行分析，結果顯示，病毒（WSSV）和細菌（副溶血弧菌）感染均能不同程度刺激對蝦體內血細胞、鰓和腸道等免疫組織中LvWDS基因的表達，一定程度上表明LvWDS參與凡納濱對蝦的抗病免疫，但其參與免疫的具體作用途徑有待進一步探究驗證。

4 結論

WDS進化十分保守，其在不同物種中的功能穩(wěn)定。LvWDS除了在凡納濱對蝦生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用外，可能還與免疫相關，在凡納濱對蝦抗病免疫中發(fā)揮作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）