談為忠 陳志

摘要：奶牛乳腺炎是一種非常復(fù)雜的疾病。研究表明，miRNA（微小核糖核酸）通過靶向靶基因影響乳腺炎，單miRNA-mRNA聯(lián)合分析未能完全解釋金黃色葡萄球菌對乳腺炎的影響。本研究成功建立了中國荷斯坦奶牛金黃色葡萄球菌乳腺外源性感染的乳腺炎模型。從感染金黃色葡萄球菌的健康乳腺組織中提取總RNA，應(yīng)用Affymentrix技術(shù)對乳腺炎基因的差異表達進行了評價。結(jié)果顯示：共有1230個不同表達的mRNA。一部分受影響的基因通過Q-PCR進行了驗證。對差異表達基因進行通路分析。采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測和分析差異表達miRNA與mRNA之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：共有329對負(fù)相關(guān)miRNA/mPNA，其中31對mRNA上調(diào)，298對mRNA下調(diào)。通過westemBlot和熒光素酶報告基因分析，評價miR-15a和白細胞介素-1受體相關(guān)的激酶樣2（IRAK2）的差異表達。miR-15a和miR-15a靶基因（IRAK2）構(gòu)成一個潛在的miRNA-mRNA調(diào)控對，可以作為預(yù)測乳腺炎反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：乳腺炎;金黃色葡萄球菌;miP，-15a;IRAK2

乳腺炎是奶牛經(jīng)常發(fā)生的一種疾病，該病可對奶牛健康造成嚴(yán)重危害，降低奶牛產(chǎn)奶質(zhì)量。金黃色葡萄球菌（S.aureus）是引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一。金黃色葡萄球菌不是乳腺專性寄生菌，但它可以定值于乳頭、乳房、扁桃體、陰道以及軀體其他損傷部位的皮膚上，金黃色葡萄球菌在牛群中一旦傳播便很難根除，主要引起慢性感染且易對常見的抗生素產(chǎn)生耐藥性。其傳播方式可分為平行傳播和垂直傳播，當(dāng)擠奶程序不當(dāng)，擠奶設(shè)備不良，乳頭有損傷時金黃色葡萄球菌就會入侵乳腺組織，經(jīng)擠奶工的手或擠奶設(shè)備進行平行傳播;還可以通過給犢牛飼喂含病牛乳腺炎的乳汁進行垂直傳播。蚊蟲叮咬刺激乳頭等也可引起產(chǎn)犢母牛感染金黃色葡萄球菌，同時，蚊蠅叮咬和環(huán)境不衛(wèi)生等因素可促進金黃色葡萄球菌性乳腺炎的大量發(fā)生，并降低奶牛的產(chǎn)奶量。

金黃色葡萄球菌附著在宿主細胞和組織上，能夠逃避宿主的免疫反應(yīng)，釋放破壞組織結(jié)構(gòu)的毒素。金黃色葡萄球菌對多種抗生素敏感，但也能獲得耐藥性。因此，金黃色葡萄球菌的研究對奶牛乳腺炎的致病性具有重要意義。盡管近幾十年來對金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的作用機制進行了大量的研究，但最近的研究主要集中在單基因分析或基因功能的驗證上。因此，缺乏利用多組學(xué)分析和分子調(diào)控的綜合研究。基因芯片技術(shù)能允許同時分析成千上萬個基因在特定組織或細胞中的表達模式，從而為細胞機制研究提供更廣闊的前景。本研究以金黃色葡萄球菌乳腺炎為研究對象，采用Affymetrix?；蚪M表達微陣列技術(shù)，對其基因表達譜進行研究。隨后，構(gòu)建了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，為今后奶牛乳腺炎的耐藥性研究提供了實驗基礎(chǔ)。

一、材料和方法

（一）菌株的選擇

選用揚州大學(xué)奶牛場的3頭健康中國荷斯坦奶牛作為研究對象。單個金黃色葡萄球菌菌落（編號：ATCC29213），來自揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院在實驗前生長至1x107 CFU/mL金黃色葡萄球菌密度。每頭奶牛都選擇了相同的兩個產(chǎn)奶區(qū)域作為測試對象22/5000。實驗組1例金黃色葡萄球菌，對照組1例PBS。將上述懸浮液或磷酸鹽緩沖鹽水5mL，用針管注入奶牛乳頭管。

（二）實驗性乳腺炎病理檢查

乳腺組織脫蠟。洗滌15min后HE染色。去除染色部分以確保二甲苯不干燥。凝固后觀察切片。

（三）RNA提取

組織提取總RNA和DNase（脫氧核糖核酸酶），按照制造商的說明書進行處理。合格的RNA樣本將用于后續(xù)研究。

（四）測序分析

采用Gene Spring 11.0軟件對質(zhì)量控制合格數(shù)據(jù)（MAS5.0）進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。差異表達基因分別采用t檢驗分析、通路分析和層次聚類分析。目的是篩選和探索與金黃色葡萄球菌性乳腺炎相關(guān)基因及其生物學(xué)意義。

（五）RT-qPCR和Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）分析

采用S-Poly（T）法測定成熟miR-NA表達水平。0.5ug高質(zhì)量總RNA用于cDNA反轉(zhuǎn)，使用RT試劑盒，miR-NA的相對表達量采用2-△ACt計算。Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）：使用RIPA buffer裂解細胞。通過SDS-PAGE對蛋白進行瓊脂糖凝膠電泳。實驗使用的抗體有：單克隆抗IRAK2和單克隆B-catin（Proteintech Gronup，66009，中國）。用化學(xué)發(fā)光ECL West-ern blot系統(tǒng)檢測信號（Pierce，USA）。

（六）細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

根據(jù)之前的研究，對牛乳腺上皮細胞（BMECs）進行了培養(yǎng)和分離。根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectami-BeTM RNAiMAX（Invitrogen，美國）將細胞轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物（60nm）或抑制劑（60nm）（Invitmgen，美國）。轉(zhuǎn)染48h后收集細胞。

（七）熒光素酶報告實驗

構(gòu)建一個包含miRNA靶向IRAK2基因的目標(biāo)位點的載體psi-CHECK-2，該載體由Not和Xho酶切后插入，隨后檢測熒光活性。所有的結(jié)構(gòu)均通過測序驗證。

（八）統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以三個獨立實驗的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用方差分析，以*p<0.05、**p<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）病理改變及組織學(xué)

奶牛乳腺感染金黃色葡萄球菌后，取健康組和金黃色葡萄球菌組乳腺組織切片并進行HE染色。400倍鏡下觀察乳腺組織，發(fā)現(xiàn)對照組有一個完整的充滿牛奶的腺泡腔。腺泡腔間組織致密完整，乳管正常（見圖1A）。相反，對金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳腺組織的檢查顯示，在腺泡腔內(nèi)積聚了大量的炎性粒細胞。腺泡壁較薄，甚至破裂或嚴(yán)重變形，泌乳管發(fā)生嚴(yán)重充血，提示臨床乳腺炎情況（見圖1B）。

（二）轉(zhuǎn)錄組分析

1、芯片雜交掃描：芯片雜交后得到的熒光強度圖像大致可以反映出芯片的雜交狀態(tài)。本實驗熒光強度圖亮度高、密度大、均勻且清晰度好。實驗證明，該方法達到了實驗要求，雜交效果良好。

2、基因芯片數(shù)據(jù)處理：在生物可重復(fù)性的情況下，即火山圖可以直觀地顯示兩組樣本間差異表達的基因。這些映射在一個圖中顯示了兩個重要的度量（折線變化，p值），被用來表達基因明顯不同的金黃色葡萄球菌組和健康組（見圖2）。在這項研究中，共有1230個基因，超過2倍的倍數(shù)，由763個基因調(diào)節(jié)，537個基因表達下調(diào)（Fc>2，P<0.05）。

3、差異基因表達通路分析：本研究利用功能注釋工具對差異表達基因進行通路分析，共篩選出15條與免疫相關(guān)的重要通路，這些通路均來自差異顯著的基因。這些通路是良好的功能指標(biāo)，可以進一步研究（見圖3）。

差異表達基因的Q-PCR驗證：從差異表達基因中篩選出8個基因進行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，這些基因的差異表達顯著（P<0.05），且趨勢與chip結(jié)果一致（見圖4）。結(jié)果表明，基因芯片分析結(jié)果可信。

（三）miR-15a特異性靶向IRAK2

選擇miR-15a和IRAK2驗證其調(diào)控關(guān)系。軟件Targetscan利用3’-UTR相互分配，識別潛在的調(diào)控miRNA。發(fā)現(xiàn)IRAK2在3’-UTR中有一個miR-15a結(jié)合位點，因此，推測IRAK2可能是miR-15a的atarget基因（見圖5B）。結(jié)果顯示：miR-15a抑制上調(diào)了IRAK2的表達，而過表達miR-15a的細胞則下調(diào)了IRAK2的表達（圖5A，圖5D）。為了證明miR-15a直接靶向IRAK2，課題組合成了一個包含miR-15a靶向位點IRAK2的3’-UTR片段。該片段被克隆到一個psi-CHECK2-載體中，構(gòu)建一個3’-UTR報告質(zhì)粒。熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-15a過表達降低了野生型報告基因3’-UTR的相對熒光素酶活性。然而，突變報告基因的相對熒光素酶活性沒有顯著差異（見圖5C）。這些結(jié)果表明：miR-15a直接靶向IRAK2 mRNA位點，并發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

A：將miR-15a模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染CMECs 48h;采用RT-qPCR法定量IRAK2表達水平（n=6）?；疑珬l代表負(fù)控制;黑條表示miR-15a模擬物或抑制劑。B和C：miR-15a在IRAK2’-UTR中的靶位點以及熒光素酶（Luc）表達載體的構(gòu)建與IRAK2 3’-UTR融合。WT表示帶有WTIRAK2 3’-UTR（684～691）的Luc報告向量;MU表示IRAK2 3’-UTR中miR-15a位點突變的Luc報告載體。D：Western blot分析miR-5a模擬物和NC處理實驗中IRAK2表達情況。western blot分析miR-15a模擬物和抑制劑對IRAK2蛋白表達的影響。轉(zhuǎn)染48h后，分別獲得總蛋白。

三、討論

動物疾病模型的建立是人為的。這一過程使動物在一定的致病因素作用下，破壞一定的組織、器官或整個身體，導(dǎo)致功能、代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)的一些變化，進而引發(fā)各種疾病。本研究利用金黃色葡萄球菌感染奶牛，建立乳腺炎模型，為乳腺炎的免疫和病理反應(yīng)研究提供參考，為乳腺炎的臨床治療提供依據(jù)。奶牛乳腺炎的病因眾多，致病微生物感染是其發(fā)病的主要因素。金黃色葡萄球菌對抗生素有很強的耐藥性。為確保乳腺炎模型能夠成功構(gòu)建并符合統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)，課題組選取了3頭奶牛，均來自同一奶牛場，在相同的飼養(yǎng)管理條件下，年齡、胎次、體重相同，產(chǎn)奶量相近，身體狀況良好。此外，這些奶牛的SCC必須低于100 000/mL，并且在牛奶中培養(yǎng)的細菌呈陰性。通過對奶牛進行的實驗，發(fā)現(xiàn)1x10CFU/mL濃度的抑菌液5mL對細菌是有效的。

乳腺炎作為奶牛的常見病，對奶牛行業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。為了更好地解決這一問題，在分子水平上闡明乳腺炎免疫反應(yīng)的相關(guān)控制機制尤為重要。已知miRNA通過對特定靶基因的作用來協(xié)調(diào)疾病反應(yīng)的某些方面。事實上，一些miRNA在應(yīng)對細菌感染時的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。之前，Li R等人對金黃色葡萄球菌進行了相關(guān)miRNA測序分析。LiR等人使用非配對測試完成了數(shù)據(jù)分析。將組樣本合并為2個生物復(fù)制體。此外，LiR等使用Audic_Claverie公式計算p值。以p值<0.05和TPM差異倍數(shù)>2為閾值，選擇差異表達miRNA。本文采用6個樣本，每組比較3個樣本。此外，本文根據(jù)樣本配對測試分析，使用DESeq2軟件的配對測試算法。該試驗采用一對一配對進行鑒別篩選。所選mima p值<0.05，TPM差異倍數(shù)為>2。樣本量不同，之前的分析為2個樣本，現(xiàn)在的分析為6個樣本。對于之前的研究，本組沒有重復(fù)計算，本研究是根據(jù)本組3次重復(fù)計算，樣本是成對的。金黃色葡萄球菌感染共導(dǎo)致1230個基因表達差異。其中763個基因上調(diào)，537個基因下調(diào)。這些基因包含研究最多的乳腺炎抗性基因：白細胞介素和白細胞介素受體基因IL6、IL17A和CXCRl。IL-6是一種多功能炎癥細胞因子，是機體細胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成員。該細胞因子在炎癥反應(yīng)中起重要作用，是由212個氨基酸組成的糖蛋白。IL-6具有多種生物學(xué)功能，在淋巴細胞、炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本實驗中IL-6也明顯上調(diào)，推測IL-6在金黃色葡萄球菌感染奶牛炎癥過程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CXCRl主要在中性粒細胞和單核細胞中表達，介導(dǎo)中性粒細胞的活化。該細胞因子促進貯藏酶的釋放，增強吞噬作用，引起機體局部炎癥反應(yīng)，從而起到殺滅致病菌的作用。在本研究中，感染金黃色葡萄球菌的奶牛體內(nèi)CXCRl的表達明顯高于對照組。本研究還證實了先前CXCRl與奶牛乳腺炎的相關(guān)性。CXCRl可能是奶?？谷橄傺椎闹匾蜻x基因。

miRNAs及其靶基因的生物學(xué)分析可以為我們研究金黃色葡萄球菌感染乳腺組織引起的乳腺炎的免疫調(diào)節(jié)過程提供良好的方法。通過比較感染金黃色葡萄球菌和對照組織中miRNA和mRNA的表達譜，可以發(fā)現(xiàn)與奶牛乳腺炎發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵miRNA和mRNA。由此產(chǎn)生的miRNA/mRNA對參與了廣泛的生物學(xué)功能。IRAK2基因在金黃色葡萄球菌組中顯著上調(diào)，屬于絲氨酸，蘇氨酸激酶家族的白細胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）。其主要作用是在炎癥細胞因子白細胞介素一1（IL-1）上調(diào)時與白細胞介素受體（IL-IR）結(jié)合。IRAK2、IRAKM、IRAK-Ib、IRAKlc在IRAK家族中為TLR信號通路負(fù)調(diào)控。研究表明，IRAK2具有顯著的負(fù)調(diào)控功能，可以減少LPS誘導(dǎo)的肥大細胞凋亡。同樣，miR-15a參與多種調(diào)節(jié)炎癥和免疫細胞分化的功能。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示：miR-15a顯著抑制熒光素酶活性，提示miR-15a對熒光素酶活性具有抑制作用。此外，通過改變miR-15a在3’UTR中的潛在結(jié)合位點，可以消除miR-15a對IRAK2的3’UTR的抑制作用。綜上所述，課題組推測miR-15a可以靶向并抑制IRAK2。本研究獲得的miRNA-mRNA調(diào)控對金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎可能起到重要作用。因此，未來的研究可以為評估細菌感染引起的乳腺炎的免疫反應(yīng)和相關(guān)控制機制提供參考。這些信息對于制定治療奶牛乳腺炎的策略可能具有一定的價值。