劉睿 郝云濤 烏蘭 劉欣然 毛瑞雪 侯超 劉思奇 麻慧娟 李勇

摘 要：目的：研究核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）抗亞健康疲勞的作用及其可能機制。方法：50只健康雄性SD大鼠隨機分成5組：正常對照組、模型對照組和3個WOPs干預(yù)組（劑量分別為220、440、880 mg/kg·BW），每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品。模型對照組和3個WOPs劑量組大鼠連續(xù)睡眠剝奪5d后，進行負(fù)重力竭游泳實驗，記錄力竭游泳時間，并測定大鼠血常規(guī)、血乳酸、肝糖原和肌糖原的變化。結(jié)果：與模型對照組相比，WOPs組大鼠力竭游泳時間明顯延長，白細(xì)胞異常增高和紅細(xì)胞及血紅蛋白降低得到了明顯改善，全血中乳酸含量顯著下降，大鼠肝糖原和肌糖原的儲備增高。結(jié)論：WOPs可以有效增強亞健康疲勞大鼠體力和運動耐力，起到防治亞健康疲勞的效果。

關(guān)鍵詞：核桃低聚肽;亞健康;疲勞;睡眠剝奪;力竭游泳

亞健康狀態(tài)，常以一多三少（一多指疲勞多;三少即三種減退：活力減退、反應(yīng)能力減退和適應(yīng)能力減退）為主要表現(xiàn)[1-3]。疲勞不僅是亞健康的重要癥狀之一，也是導(dǎo)致亞健康發(fā)生發(fā)展的重要原因[4]。“中國適度勞動研究”的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國有30%的勞動力處于“過勞死”邊緣，60%長期處于過勞狀態(tài)[5]。但目前臨床上尚缺乏有效的治療方法，哌甲酯、利他林等藥品可以達(dá)到較好的緩解疲勞的效果，但因具有一定的副作用與成癮性，不宜長期服用[6]。因此，研究亞健康疲勞的發(fā)生發(fā)展機制及尋找安全有效的方法來預(yù)防和緩解亞健康狀態(tài)極為重要。

現(xiàn)代研究表明，外源性生物活性肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)激素與酶抑制等多種生理功能。由于外源性活性肽原料廣泛且進入機體后可發(fā)揮與內(nèi)源性活性肽相似的生理作用，極具研究應(yīng)用價值，是當(dāng)前最熱門的研究方向之一[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低聚肽比單個氨基酸的吸收更有效，并能直接參與蛋白質(zhì)的合成，有效提高了蛋白質(zhì)的吸收利用率[9-10]。核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）是利用生物酶解技術(shù)從核桃蛋白中提取的小分子生物活性肽，研究發(fā)現(xiàn)，WOPs具有提高記憶力[11]、抗輻射[12]、抗氧化[13]、潤腸通便[14]、提高性功能[15]等多種生物活性。研究報道，核桃多肽可以延長實驗動物力竭游泳時間，加速乳酸消除，有效促進疲勞的恢復(fù)[16-18]。但尚未見WOPs用于治療亞健康疲勞狀態(tài)的相關(guān)報道，因此，本研究通過采用復(fù)合造模法即睡眠剝奪（中樞疲勞）與負(fù)重力竭游泳（外周疲勞）相結(jié)合來制備建立亞健康疲勞大鼠模型[19-22]，根據(jù)大鼠力竭游泳時間、血常規(guī)、血乳酸、肝糖原來評價WOPs對亞健康疲勞大鼠的作用，為研究WOPs干預(yù)亞健康疲勞的治療機理奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

WOPs，外觀為淡黃色固體粉末，由北京天肽生物科技有限公司提供。通過高效液相色譜法分析其分子量及氨基酸組成發(fā)現(xiàn)分子量小于1 000Da的小分子低聚肽占86.5%，小于2 000Da的肽類總量高達(dá)96.5%，其水解氨基酸含量為53.15g/100g，游離氨基酸含量為2.98g/100g，其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量較多。

1.2 主要試劑和儀器

全血乳酸測試試劑盒，貨號A019-1，南京建成;肝/肌糖原檢測試劑盒，貨號A043，南京建成。大鼠游泳箱（80cm×18cm）;Nihon Kohden Celltac 2全自動血球計數(shù)儀，日本光電工業(yè)株式會社;低溫高速離心機，德國Eppendorf公司;電熱恒溫水浴鍋，北京天林恒泰科技有限公司;BMG FLUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀，德國 BMG LABTECH公司。

1.3 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠50只，體重（250±20）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供（實驗動物許可證號：SYXK（京）2016-0041;實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0010）。動物飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境，溫度為（22±2）℃，相對濕度為50%～60%，晝：夜明暗交替時間為12h∶12h。實驗動物單籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，第1周行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，將大鼠放入水深50cm，水溫維持在（30±1）℃的游泳桶中進行游泳訓(xùn)練，每次訓(xùn)練10min，每天1次，連續(xù)3d。適應(yīng)性游泳結(jié)束后，將50只大鼠隨機分為5組，每組10只：正常對照組，模型對照組，核桃低聚肽低、中、高劑量組（劑量分別為220、440、880 mg/kg·BW，分別對應(yīng)WOPs 1、WOPs 2、WOPs 3組）。臨床上尚沒有針對亞健康疲勞狀態(tài)的上市藥物，因此本研究中未設(shè)陽性對照組[23]。實驗期間，大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食。

1.4.2 亞健康疲勞大鼠模型的建立 分組結(jié)束后，參照文獻，采用睡眠剝奪+5%負(fù)重游泳的復(fù)合方式制備亞健康疲勞大鼠模型[19-22]。具體方法為：空白對照組大鼠正常飼養(yǎng)，其余4組大鼠放入裝有2.2cm水高的大鼠飼養(yǎng)盒中，每籠1只，連續(xù)5d，期間自由飲水進食，水的溫度與室溫相近，維持（23±1）℃，每日早晚各換水1次。造模期間，每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品1次，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水，WOPs組給予相應(yīng)濃度受試物，灌胃量為1mL/100g。每日觀察各組大鼠的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、攝食及日?；顒忧闆r等。睡眠剝奪5d后，對各組大鼠行5%負(fù)重游泳實驗，造成亞健康疲勞大鼠模型。

1.4.3 負(fù)重游泳實驗 睡眠剝奪5d后，取各組大鼠于末次給予受試樣品1h后[24]，在鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，將大鼠置于游泳箱中游泳[水深50cm，水溫（30±1）℃]，記錄大鼠自游泳開始至力竭的時間，作為大鼠負(fù)重游泳時間，游泳運動期間對動物的運動能力及活動狀態(tài)進行觀察記錄。采用力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠游泳協(xié)調(diào)性顯著性下降、身體下沉、水淹沒鼻尖至再次浮出水面超過10s[25-26]。負(fù)重游泳結(jié)束后，采用乙醚麻醉處死大鼠，股動脈收集血液，并快速分離肝臟和腓腸肌。采用全自動血球計數(shù)儀及根據(jù)試劑盒說明書進行血常規(guī)、血乳酸、肝糖原和肌糖原的檢測。

1.5 統(tǒng)計方法

用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行單因素方差分析，采用LSD法進行組間的統(tǒng)計檢驗;變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗動物一般狀況觀察

正常對照組大鼠精神狀態(tài)正常、活潑好動、反應(yīng)靈敏、皮毛光潔整齊、體重增加。模型對照組大鼠精神狀態(tài)明顯欠佳、倦怠、煩躁、易激惹，毛色欠光澤，個別遺留有灰暗污漬，反應(yīng)能力降低，消瘦，體重降低。WOPs各組大鼠精神狀態(tài)及行為異常情況較模型對照組有所改善，且隨著WOPs干預(yù)劑量的增高表現(xiàn)情況越為好轉(zhuǎn)。

2.2 WOPs對亞健康疲勞大鼠體重和負(fù)重游泳時間的影響

如表1所示，大鼠初始體重各組間無顯著性差異（P>0.05）。實驗造模5d后，與空白對照組相比，模型對照組和3個WOPs干預(yù)組大鼠終末體重明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在負(fù)重力竭游泳測試中，模型對照組大鼠游泳時間低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。WOPs組大鼠游泳時間長于模型對照組，其中核桃低聚肽中、高劑量組WOPs 2、WOPs 3組與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05、P<0.01）。

2.3 WOPs對亞健康疲勞大鼠血常規(guī)的影響

2.3.1 WOPs對亞健康疲勞大鼠白細(xì)胞的影響 與正常對照組相比，模型對照組白細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。WOPs 1、WOPs 2、WOPs 3組低、中、高劑量干預(yù)組白細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)和淋巴細(xì)胞計數(shù)均低于模型對照組，其中WOPs 1組白細(xì)胞計數(shù)與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05）;WOPs 3組白細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)及淋巴細(xì)胞計數(shù)與模型對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）（表2）。

2.3.2 WOPs對亞健康疲勞大鼠紅細(xì)胞的影響 與空白對照組相比，模型對照組紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型對照組相比，3個WOPs干預(yù)組紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積明顯增高（P<0.05或P<0.01）。WOPs干預(yù)組紅細(xì)胞體積分布寬度均低于模型對照組，其中WOPs 1組與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05）。平均紅細(xì)胞體積在各組間均無顯著性差異（P>0.05）（表3）。

2.3.3 WOPs對亞健康疲勞大鼠血紅蛋白的影響 如表4所示，模型對照組大鼠血紅蛋白含量、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度均低于正常對照組，其中血紅蛋白含量與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型對照組相比，3個WOPs干預(yù)組血紅蛋白含量均明顯升高（P<0.05或P<0.01），其中WOPs 1組平均血紅蛋白含量與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05）;WOPs 2、WOPs 3組平均血紅蛋白濃度明顯高于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.4 WOPs對亞健康疲勞大鼠全血中乳酸含量的影響

如附圖所示，模型對照組血乳酸含量明顯高于空白對照組（P<0.05）。WOPs干預(yù)組血乳酸含量與模型對照組相比有降低的趨勢，其中WOPs 2、WOPs 3組與模型對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05、P<0.01）。

2.5 WOPs對亞健康疲勞大鼠肝糖原的影響

如表5所示，與空白對照組相比，模型對照組大鼠肝糖原和肌糖原含量均有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。3個WOPs干預(yù)組肝糖原和肌糖原含量均高于模型對照組，其中WOPs 1、WOPs 3組肝糖原含量明顯高于模型對照組（P<0.05、P<0.01）;WOPs 1、WOPs 2組肌糖原含量顯著高于模型對照組（P<0.05）。

3 討論

現(xiàn)有關(guān)亞健康疲勞的實驗研究主要以大鼠和小鼠為研究對象，多以跑臺或游泳作為單一訓(xùn)練手段來制備實驗疲勞動物模型。但現(xiàn)今社會亞健康疲勞多是由于精神壓力和體力活動疊加共同引起的，單一因素亞健康疲勞動物模型的重復(fù)性、可靠性、相似性較差，不能準(zhǔn)確反映亞健康疲勞引起的機體損傷模式[2，27]。因此，本研究采用睡眠剝奪（中樞疲勞）與負(fù)重力竭游泳（外周疲勞）復(fù)合造模法，在運動疲勞的基礎(chǔ)上添加精神上的影響，來制備亞健康疲勞大鼠模型，將大鼠放入盛有2.2cm水深的動物籠中，迫使大鼠保持站立的姿態(tài)不能睡眠，從而導(dǎo)致其中樞疲勞;游泳時大鼠本能的一種運動方式，在進行游泳運動時不會表現(xiàn)出強烈的抵觸行為，不容易產(chǎn)生其他的應(yīng)激源[19，22，24]。實驗中模型對照組大鼠體重明顯下降、精神狀態(tài)差、易激惹、易疲勞，而WOPs干預(yù)則在一定程度上減緩了大鼠體重的下降，改善了大鼠的精神狀態(tài)。大鼠游泳疲勞模型是目前國內(nèi)外比較公認(rèn)的實驗動物疲勞模型，本實驗采用5%負(fù)重力竭游泳模型，力竭是疲勞長期積累而引起機體功能紊亂的病理狀態(tài)，負(fù)重力竭游泳時間的長短可以反映動物疲勞的程度，是評價實驗動物抗疲勞能力的有效指標(biāo)[25，28]。本研究中，模型對照組負(fù)重力竭游泳時間與正常對照組相比下降明顯（P<0.05）。WOPs各劑量組大鼠負(fù)重游泳時間的持續(xù)時間均高于模型對照組，其中WOPs 2、WOPs 3組大鼠負(fù)重游泳時間相比模型對照組顯著延長（P<0.05、P<0.01），表明WOPs有效增強了亞健康疲勞大鼠體力和運動耐力，起到了防治亞健康疲勞的效果。

白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白等相關(guān)指標(biāo)是血常規(guī)檢測的核心內(nèi)容[29]。白細(xì)胞在疲勞相關(guān)的肌肉損傷引起的炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[30-31]。在本實驗中，模型對照組白細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)與正常對照組相比均顯著升高，說明亞健康疲勞刺激激發(fā)了大鼠體內(nèi)白細(xì)胞的大量產(chǎn)生;WOPs干預(yù)組白細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)和淋巴細(xì)胞計數(shù)均低于模型對照組，其中WOPs 1、WOPs 3組白細(xì)胞計數(shù)與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05），WOPs 3組單核細(xì)胞計數(shù)及淋巴細(xì)胞計數(shù)與模型對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05、P<0.01），提示W(wǎng)OPs在維持機體白細(xì)胞水平時可以起到有效的作用。本實驗中，模型對照組紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積與空白對照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明大鼠力竭運動后，紅細(xì)胞數(shù)量有所減少;WOPs干預(yù)組紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積與模型對照組相比則明顯增高（P<0.05或P<0.01），提示W(wǎng)OPs干預(yù)可適當(dāng)提高紅細(xì)胞的含量。血紅蛋白含量是運動員身體機能檢測中極為重要的一項。本研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血紅蛋白含量與正常對照組相比顯著降低（P<0.05），說明睡眠剝奪加力竭游泳運動降低了大鼠血紅蛋白的含量;WOPs干預(yù)組血紅蛋白含量與模型對照組相比明顯升高（P<0.05），表明WOPs有益于疲勞的恢復(fù)。

研究發(fā)現(xiàn)，血乳酸水平可以有效反映機體有氧代謝能力、疲勞的產(chǎn)生和消除速度[32]。本研究中，WOPs干預(yù)組全血中乳酸含量與模型對照組相比有不同程度的下降，且WOPs 2、WOPs 3組與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05、P<0.01），表明WOPs可有效促進乳酸的代謝與排除，降低大鼠體內(nèi)血乳酸堆積，延長運動時間，延緩疲勞的產(chǎn)生或加速疲勞的消除。此外，糖原儲備可作為評價機體抗疲勞能力的重要指標(biāo)[28]。正常運動時機體的能量提供主要來自于糖原的分解，其中肌糖原是維持肌肉運動的重要能源，肝糖原分解是血糖維持穩(wěn)定的重要保障[33]。研究發(fā)現(xiàn)，肌糖原消耗增加時，機體將分解肝糖原產(chǎn)生葡萄糖進入血液，以維持血糖水平;當(dāng)肝糖原儲備耗竭時，機體不能維持正常的血糖水平，將會導(dǎo)致大腦供能不足，從而影響機體健康引起疲勞[34]。本研究中，WOPs干預(yù)組肝糖原和肌糖原含量均高于模型對照組，其中WOPs 1、WOPs 3組肝糖原含量顯著高于模型對照組（P<0.05、P<0.01）;WOPs 1、WOPs 2組肌糖原含量與模型對照組相比差異具有顯著性（P<0.05），表明WOPs可以增強大鼠肝糖原和肌糖原的儲備，提高運動耐力，延緩疲勞。

綜上所述，本研究通過模擬亞健康疲勞相關(guān)發(fā)生發(fā)展因素，使大鼠站立于水盒中連續(xù)5d，并結(jié)合負(fù)重力竭游泳，成功制備出亞健康疲勞大鼠模型。WOPs干預(yù)則可明顯改善亞健康疲勞大鼠精神狀態(tài)，顯著提高大鼠力竭游泳時間，改善亞健康疲勞狀態(tài)引起的血常規(guī)異常，降低全血中乳酸的堆積和提高機體肝糖原與肌糖原含量，促進了機體疲勞的恢復(fù)，縮短了亞健康康復(fù)時間，從而為研制開發(fā)新型健康的生物活性肽類抗亞健康疲勞功能食品提供實驗基礎(chǔ)。

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Abstract：Objective To evaluate effects of walnut oligopeptides （WOPs）in fatigue-type sub-health rats and explore the possible underlying mechanism.Method Totally 50 male SD rats were randomly divided into five experimental groups including normal control group，model control group，and three WOPs intervention groups.The normal control group and model control group were administered distilled water，and the three intervention groups administered WOPs by orally gavage at a dose of 220，440，and 880 mg/kg of body weight，respectively.After the rats in model control group and WOPs groups were sleep deprivation for five consecutive days，the exhausted swimming time of rats in all groups were observed，the change of routine blood，lactic acid and liver glycogen storage were measured.Result It was observed that WOPs could significantly prolong the swimming time，improve the abnormal increase in white blood cells and reduction in red blood cells and hemoglobin，decrease the accumulation of blood lactic acid，and enhance the glycogen storage of liver.Conclusion WOPs have beneficial effects of anti-fatigue-type sub-health，which may be a novel anti-fatigue-type sub-health natural substance.

Keywords：walnut oligopeptides（WOPs）;sub-health;fatigue;sleep deprivation;exhaustive swimming test

（責(zé)任編輯 李婷婷）