劉秀花 梁梁 杜風光 王有名 梁峰

摘 要：木糖為自然界中最豐富和經(jīng)濟的糖資源之一，但木糖很少被證明是野生型微藻的碳源。本實驗的目的是確定小球藻的最適培養(yǎng)基以及對糖的具體利用情況。通過對小球藻干重和培養(yǎng)后的藻液中糖含量的測定發(fā)現(xiàn)，在HSM培養(yǎng)基中，小球藻生長較好，最適pH為6.5。添加木糖對小球藻的生長存在一定的抑制作用，隨著糖含量的增加，抑制越來越嚴重。在木糖含量擴大培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，木糖耐受在6g/L左右。之后進行混合糖（木糖和葡萄糖）培養(yǎng)小球藻，確定混合糖培養(yǎng)效果明顯好于單糖培養(yǎng);經(jīng)過薄層層析和DNS對培養(yǎng)后的藻液進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有葡萄糖存在時，小球藻優(yōu)先利用葡萄糖。

關(guān)鍵詞：小球藻;木糖;葡萄糖;薄層層析

中圖分類號：S963.213 文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2019）17-0136-06

Abstract： Xylose is one of the most abundant and economical sugar resources in nature， but xylose is rarely proven to be a carbon source for wild-type microalgae. The purpose of this experiment was to determine the optimum medium for Chlorella and the specific use of sugar. By measuring the dry weight of the Chlorella and the sugar content in the algae after the culture， it was found that the Chlorella grew well in the HSM medium， and the optimum pH was 6.5. The addition of xylose had a certain inhibition on the growth of Chlorella， and as the sugar content increases， the inhibition became more and more serious. In the expansion of xylose content， xylose tolerance was found to be around 6 g/L. After the cultivation of Chlorella with mixed sugar （xylose and glucose）， it could be confirmed that the mixed sugar culture effect was significantly better than the monosaccharide culture， and the cultured algae liquid was measured by thin layer chromatography and DNS， and it was found that there was glucose present. Chlorella preferentially utilized glucose.

Keywords： Chlorella;xylose;glucose;thin layer chromatography

1 研究背景

小球藻為綠藻門小球藻屬（Chlorella sp）普生性單細胞綠藻，以光合自養(yǎng)生長繁殖，分布廣泛，尤以淡水水域種類為最多，生物量大。小球藻通過光合作用將CO2轉(zhuǎn)化為生物燃料、食物、飼料和高價值的生物活性物質(zhì)。以小球藻為原料，可以生產(chǎn)幾種不同的可再生生物燃料，如通過小球藻生物質(zhì)的厭氧消化生產(chǎn)沼氣;小球藻的油脂可以提煉生物柴油;光生物學上的生物產(chǎn)氫等[1]。另外，小球藻具有多種保健和藥理作用，是目前保健食品開發(fā)應(yīng)用較理想和研究較多的微藻之一。通過對微藻生長過程中能量和碳代謝的分析，Yang等人[2]證明了異養(yǎng)和混合營養(yǎng)培養(yǎng)比光養(yǎng)細胞產(chǎn)生了更多的ATP和生物量。

但是，有機碳供應(yīng)的可用性和可持續(xù)性仍然是大規(guī)模應(yīng)用的限制因素。木質(zhì)纖維素材料是有前途的原料，這主要是因為其較為豐富且成本相對較低。單糖可以從木質(zhì)纖維素的水解獲得，且可以用作微藻異養(yǎng)或混合營養(yǎng)培養(yǎng)的碳源。D-葡萄糖（主要來自纖維素）和D-木糖（來自半纖維素）是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的兩種主要碳水化合物。D-葡萄糖被證明是許多微藻生長的合適碳源，如C. rypthecodinium cohnii， Schizochytrium sp，Nitzschia laevis，Euglena gracilis，Galdieria sulphuraria和Chlorella等[3]。盡管學術(shù)界已經(jīng)深入研究了用D-葡萄糖培養(yǎng)微藻，但關(guān)于D-木糖利用的報道非常有限。缺乏有效的攝取系統(tǒng)和（或）相關(guān)的代謝途徑可能是導致這種情況的主要原因。Neish[4]評估了各種碳水化合物對小球藻（Chlorella vulgaris）生長的影響。結(jié)果表明，D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖和β-葡萄糖苷是藻類生長的碳和能量的物質(zhì)來源，但很少甚至沒有關(guān)于包括木糖的戊糖生長的模擬。同樣，Samejima和Myers[5]發(fā)現(xiàn)盡管葡萄糖和半乳糖支持微藻生長，但是C. pyrenoidosa和小球藻橢球體很難在木糖上生長。此外，Hassall[6]證明D-木糖不能用作微藻類pyrenoidosa化學合成的基質(zhì)，相反，其作為光合作用的特異性抑制劑，在存在0.5%D-木糖（33mM）的情況下，細胞分裂被阻止并且微藻的顏色在幾天內(nèi)消失。

本文的研究目的是確定小球藻的最適培養(yǎng)基以及對糖的具體利用情況，將小球藻進行21d光照培養(yǎng)，對培養(yǎng)后的藻液進行DNS和薄層層析分析。通過不同培養(yǎng)基的比對、確定最適pH、小球藻對木糖的最大耐受、混合糖（木糖和葡萄糖）培養(yǎng)及薄層層析分析糖的具體利用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在一定范圍（0.5g/L）內(nèi)，木糖對小球藻的生長并不表現(xiàn)出抑制;pH也是影響小球藻利用木糖生長的重要因素。此外還發(fā)現(xiàn)，葡萄糖存在時會降低木糖的利用，這也很好地佐證了葡萄糖為小球藻生長最佳碳源的結(jié)論。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

小球藻（Chlorella. sp）為生物精煉河南省工程實驗室保藏小球藻L4;HSM培養(yǎng)基、BBM培養(yǎng)基溶液和BG-11用于小球藻營養(yǎng)培養(yǎng)基。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)。接種前，從斜面挑取小球藻在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于26℃光照下培養(yǎng)，獲得生長對數(shù)期的藻液，按107/100mL計數(shù)接種（采用血球計數(shù)法計數(shù)）于相應(yīng)培養(yǎng)基，每組三個重復(fù)，后置于26℃照射21d。

2.2.2 生物量測定。收集適量藻液，于8 000r/min離心5min，沉淀于85℃下烘2h，后采用差重法稱取干重。

2.2.3 還原糖測定。培養(yǎng)后的藻液經(jīng)過離心后取上清，再進行DNS測定，計算糖利用率[7];培養(yǎng)后的藻液經(jīng)離心后進行薄層層析分析，根據(jù)顯色結(jié)果分析小球藻對糖的具體利用情況。

2.3 實驗設(shè)計

本研究對比了小球藻在三種不同的培養(yǎng)基HSM、BBM和BG-11中的干重和木糖利用率，設(shè)置的木糖含量梯度為0.5、1.0、1.5g/L和2.0g/L，pH為7，經(jīng)過21d光照培養(yǎng)后測小球藻的干重和木糖利用率?；贖SM培養(yǎng)基，分析小球藻利用木糖和葡萄糖的情況。前期研究顯示，木糖會抑制小球藻生長，因此，為了使實驗效果更明顯，選擇糖含量為2.0g/L。此外，為了分析pH對小球藻生長的影響，設(shè)置pH梯度為pH6、pH6.5、pH7、pH7.5和pH8。經(jīng)過相同的培養(yǎng)條件后測小球藻干重和木糖利用率。為了分析小球藻對木糖的最大耐受，通過增加木糖含量進行實驗。設(shè)置的木糖含量為1、2、4、6、8、10g/L和12g/L，pH選最優(yōu)pH，為6.5，同樣經(jīng)過21d光照培養(yǎng)，測小球藻干重和木糖利用率。為了進一步優(yōu)化實驗，對其進行混合糖培養(yǎng)，由此來確定混合糖培養(yǎng)是否有利于小球藻的生長。為了分析混合糖中各組分的具體利用情況，采用薄層層析對培養(yǎng)后的藻液進行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同培養(yǎng)基對小球藻生長的影響

小球藻在三種不同的培養(yǎng)基中經(jīng)過21d培養(yǎng)后，生長情況如圖1所示。培養(yǎng)液顏色的深淺可以大體反映小球藻的生物量。從圖中可以明顯看出：小球藻在HSM培養(yǎng)基中顏色最深，說明其生長得較好;在BG11培養(yǎng)基中顏色較淺;BBM培養(yǎng)基中顏色較BG11更淺。單獨來看每一種培養(yǎng)基，在HSM中，木糖濃度的增加對小球藻生長的影響不明顯;BG11培養(yǎng)基中每組分小球藻生長情況差異也不大;而在BBM培養(yǎng)基中，可以明顯看出小球藻液存在一定的梯度，最右邊顏色最深的為CK，之后木糖含量增加，小球藻液顏色越來越淺，可見，木糖對小球藻的生長存在抑制作用。小球藻具體的生物量以及木糖的利用情況如圖2和圖3所示。

從圖2和圖3可以看出，在HSM培養(yǎng)基中，添加木糖對小球藻生長存在一定的影響，當木糖含量為0.5g/L和1.0g/L時，小球藻的生物量略高于CK;而隨著木糖含量的增加，小球藻的生物量開始下降，說明木糖開始抑制小球藻的生長。整體來看，添加木糖使得小球藻的生物量先增加后降低。在BG11培養(yǎng)基中，CK的小球藻生物量高于實驗組，說明木糖抑制了小球藻的生長。但木糖含量不同，對小球藻生長的抑制情況也不同，當木糖含量為1.0g/L和1.5g/L時，小球藻的生物量有所增加，但仍低于CK。在BBM培養(yǎng)基中，添加木糖對小球藻的生長抑制明顯，實驗組的生物量明顯低于CK。

就三種培養(yǎng)基而言，三種培養(yǎng)基中的CK差異也明顯，在HSM培養(yǎng)基中，小球藻生長明顯好于其他兩種培養(yǎng)基。這主要是因為這三種培養(yǎng)基中的鹽分、碳源和氮源含量不同：HSM培養(yǎng)基中的C含量要高于其他兩種培養(yǎng)基;BG11和BBM中的N含量相對較高。此后的實驗都基于HSM培養(yǎng)基。

3.2 初始糖的不同及pH對小球藻生長的影響

添加的初始糖為木糖和葡萄糖，含量都為2g/L時，小球藻在不同pH的HSM培養(yǎng)基中的干重和糖利用率如圖4和圖5所示。

從圖4和圖5可以看出，添加的初始糖不同，小球藻的生物量也存在一定差異。在相同的pH下，初始糖為葡萄糖時，小球藻的生物量相對好于木糖，只有在pH為6.5時，初始糖為木糖時小球藻生物量略高于葡萄糖。造成這種現(xiàn)象的原因是葡萄糖作為碳源能更快地進入代謝循環(huán)，適宜小球藻的生長，而木糖并不能直接作為小球藻的碳源，木糖含量的增加或者pH的改變都可能抑制小球藻的生長。初始糖為木糖時，隨著PH的增加，小球藻的生物量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢;pH為6.5時，小球藻生物量最高，之后開始下降。圖5的木糖利用率趨勢和圖4的小球藻干重趨勢大致相同。當初始糖為葡萄糖時，pH為6、7和8時，小球藻生物量差異不大;pH為7.5時，小球藻生物量最低，且葡萄糖的利用率也是最低?？梢?，葡萄糖的利用率整體高于木糖。綜上，pH也是影響小球藻生長的重要條件。初始糖為木糖時小球藻最適宜的pH為6.5，此后實驗選擇6.5為初始pH。

3.3 小球藻對木糖的最大耐受

增加木糖含量時，小球藻的生物量和木糖利用率如圖6所示。

從圖6可知，CK和木糖濃度為1.0g/L時，小球藻生物量高于上述結(jié)果，說明小球藻在pH為6.5時生長較pH為7.0時有明顯優(yōu)勢。同時可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中只有木糖時，隨著糖含量的增加，小球藻的生物量隨之下降，說明木糖對小球藻的抑制作用越來越嚴重，木糖含量為6g/L時，小球藻的生物量僅為0.79g/L。圖中并未顯示出6g/L后的實驗數(shù)據(jù)，這是因為木糖含量繼續(xù)增加時，小球藻的生長已經(jīng)嚴重受影響，不能正常生長而死亡，故無實驗數(shù)據(jù)。由此可得出，小球藻對木糖的最大耐受在6g/L左右。

3.4 混合糖培養(yǎng)對小球藻生長的影響

同時添加木糖和葡萄糖，總糖含量為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5g/L，以木糖∶葡萄糖分別為1∶1和1∶1.5進行實驗，觀察對小球藻生長的影響。培養(yǎng)后測得的小球藻生物量和利用率如圖7和圖8所示。

通過這兩組實驗可以明顯發(fā)現(xiàn)，混合糖培養(yǎng)效果好于單糖培養(yǎng)。當木糖∶葡萄糖為1∶1時，小球藻的生物量隨著糖含量的增加不斷增加，但糖利用率卻在下降。干重在糖含量為5g/L時出現(xiàn)最大，為2.01g/L，而糖利用率在糖含量為2.5g/L時出現(xiàn)最大，為70.31%。當木糖：葡萄糖為2∶3時，大體趨勢和木糖∶葡萄糖為1∶1時相似，最大干重出現(xiàn)在木糖含量4.5g/L時，為2.06g/L，最大的糖利用率出現(xiàn)在糖含量3g/L時，為76.25%。這可能是由于添加了葡萄糖之后，會改善木糖對小球藻生長的抑制。為了分析混合糖中木糖和葡萄糖的具體利用情況，下面進行薄層層析分析糖的具體利用情況。

3.5 薄層層析分析混合糖利用情況

此次進行分析的總糖含量為6g/L，在木糖∶葡萄糖分別為1∶1和1∶1.5時進行實驗，顯色后的情況如圖9所示。

注：T為實驗組;M為糖標準液;G為葡萄糖;X為木糖。

通過圖譜分析發(fā)現(xiàn)，實驗組中都未顯示出葡萄糖的點，說明葡萄糖大部分被利用，而木糖點的顏色會略淺于實驗組，說明木糖被少部分利用。這個圖直觀反映了混合糖培養(yǎng)時小球藻會優(yōu)先利用葡萄糖，當葡萄糖用完時才開始利用木糖。基于這個猜想，經(jīng)過DNS計算過利用總糖后，對這次實驗數(shù)據(jù)進行進一步處理，結(jié)果如表1所示。

從表中可以清晰地發(fā)現(xiàn)，加入葡萄糖過多，導致木糖幾乎沒有利用。當木糖∶葡萄糖=1∶1時，木糖可以被少許利用，和之前只加木糖的實驗相比，木糖的利用明顯降低。當木糖∶葡萄糖=2∶3時，木糖幾乎沒有被利用。分析認為，當有葡萄糖存在時，小球藻會優(yōu)先利用葡萄糖，當葡萄糖耗盡時才開始利用木糖;加入葡萄糖確實有利于小球藻生長，但會限制木糖的利用。因此，為了提高小球藻利用木糖的量，應(yīng)添加適量的葡萄糖。

4 結(jié)論

通過分析上述實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，小球藻在HSM培養(yǎng)基中可以利用木糖，且小球藻的生物量也明顯好于其他兩種培養(yǎng)基;在木糖含量為0.5g/L時，小球藻生長情況較好且木糖的利用率也較高。此濃度下，并未表現(xiàn)出木糖對小球藻生長的抑制，但木糖含量增加會對小球藻生長產(chǎn)生抑制作用。從小球藻對木糖最大耐受實驗中可以看出，只有木糖存在時，木糖含量增加，小球藻生長情況變差，木糖含量超過6g/L后，小球藻已經(jīng)不能正常生長。之后進行的不同pH培養(yǎng)可以發(fā)現(xiàn)，pH對小球藻的生長確實存在一定影響，當pH為6.5時，小球藻的干重明顯優(yōu)于pH為7時，因此之后部分實驗pH選為6.5。在進行混-

基于此猜想，對DNS測糖利用的數(shù)據(jù)進行進一步分析發(fā)現(xiàn)，在混合糖實驗中，假設(shè)葡萄糖全部被利用，經(jīng)過計算，發(fā)現(xiàn)木糖的利用最大，為0.7g/L，在單糖實驗中，當木糖含量為6g/L時，木糖利用可以達到5.4g/L，而在2g/L木糖單獨存在時，木糖的利用可以達到1.8g/L，相比于只加木糖，添加葡萄糖使得小球藻對木糖的利用大大降低。通過這些數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著木糖含量的增加，小球藻利用木糖的量也在增加，但其生長已經(jīng)受到抑制。當培養(yǎng)基中加入葡萄糖后，小球藻的生長情況可以得到明顯改善，但木糖的利用明顯減少，小球藻會大量利用葡萄糖，也就是說，加入葡萄糖可以緩解木糖對小球藻生長的抑制。在之后的實驗中，會繼續(xù)探究小球藻對木糖的利用情況，尋找葡萄糖的最適含量，以得到小球藻生長最適宜的糖濃度。

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