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        小球藻固定CO2能力與油脂積累條件研究

        2019-09-10 15:18:32梁梁杜風(fēng)光陳嘉山劉秀花梁峰
        河南科技 2019年17期
        關(guān)鍵詞:小球藻

        梁梁 杜風(fēng)光 陳嘉山 劉秀花 梁峰

        摘 要:小球藻生長速率快、易于培養(yǎng)且能進行光合作用,可作為生物法固碳的優(yōu)良材料。而CO2作為全球變暖的元兇,如何減少大氣中CO2含量已是當(dāng)今熱門話題。但目前對小球藻去除CO2的研究中,大規(guī)模培養(yǎng)的較少。因此,本實驗以120L玻璃封閉的自制大容器為培養(yǎng)器,以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L為培養(yǎng)基,培養(yǎng)時持續(xù)通入CO2和空氣,通氣量為1L/min,CO2的濃度為6.56%,并進行光照、水循環(huán)等,對小球藻進行大規(guī)模培養(yǎng)。結(jié)果表明:小球藻對CO2的去除率最高達24.09%,鮮重為3.624g/L,產(chǎn)油能力為0.14g/L。

        關(guān)鍵詞:小球藻;大規(guī)模培養(yǎng);生物固碳;生物燃料

        中圖分類號:Q945 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1003-5168(2019)17-0131-05

        Abstract: Chlorella has a high growth rate, is easy to cultivate and can perform photosynthesis, and can be used as an excellent material for biological carbon fixation. CO2, as a greenhouse gas, is the main culprit of global warming. How to reduce CO2 content in the atmosphere is a hot topic today. In the current study of CO2 removal by Chlorella, large-scale cultures are less common. Therefore, in this experiment, a large-scale culture of Chlorella vulgaris was carried out in a 120L glass-enclosed self-made container with HSM1 and phytohormone 6-BA 0.5mg/L as the medium. During the culture, CO2 and air were continuously injected with a ventilation rate of 1L/min and a concentration of CO2 of 6.56%. Light and water circulation were also carried out to culture Chlorella vulgaris on a large scale. The results showed that the highest CO2 removal rate of Chlorella was 24.09%, fresh weight was 3.624g/L, and oil production capacity was 0.14g/L.

        Keywords: Chlorella;large-scale culture;biological carbon fixation;biofuel

        小球藻(Chlorella)為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻,是一種球形單細(xì)胞淡水藻類,直徑3~8μm,內(nèi)有一個周生、杯狀或片狀的色素體,是一種高效的光合植物。微藻固碳已經(jīng)成為消減溫室氣體排放的新的研究熱點[1]。自養(yǎng)型藻類主要依靠CO2和光能生長,在光合作用過程中,藻類吸收CO2,并將其轉(zhuǎn)化為糖、蛋白質(zhì)、油脂等生物質(zhì)能。藻類對光量子(太陽能)的吸收轉(zhuǎn)化率可達8%~10%,而一般農(nóng)作物的光能轉(zhuǎn)化率只有1%~3%[2]。每生產(chǎn)100t微藻,約可吸收利用470t碳元素,可轉(zhuǎn)化掉185t CO2。因此,藻類養(yǎng)殖是控制和減少大氣中CO2的一種有效途徑[3]。在300mL的小培養(yǎng)容器中,對CO2的去除率為27.69%,固碳量達到256.86mg/(L·h)[4],而小球藻去除CO2的研究必將邁向大容器、大規(guī)模培養(yǎng)。小容器培養(yǎng)與大容器培養(yǎng)中存在許多微小且令人意想不到的問題,這些問題也是在實驗的深入研究中所必須要面臨的。

        對于以消減大氣中CO2為目的大規(guī)模微藻培養(yǎng),其主要利用微藻生長速度快、易于培養(yǎng)且能達到較高密度培養(yǎng)的特性來進行本次實驗。本實驗選用實驗室分離純化的一株小球藻,生長迅速,抗逆性強,且能在雜藻及雜菌中優(yōu)勢生長,可作為CO2減排藻株。以HSM1添加6-BA為其培養(yǎng)基,并在培養(yǎng)過程中,對光照強度、通氣量、容器內(nèi)水循環(huán)等進行控制。本文主要分析大容器培養(yǎng)中,每個時期的CO2去除率,并觀察其變化,分析變化的內(nèi)外原因。同時,觀察并測量每個時期的生物量,最后將其回收并測量藻內(nèi)含油量,以為后續(xù)生物精煉方向的研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        試驗菌株為小球藻,來自于生物精煉河南省工程實驗室。本實驗的基本培養(yǎng)基為HSM1培養(yǎng)基,其成分為:NH4Cl 0.500g/L,K2HPO4 1.440g/L,KH2PO4 0.720g/L,MgSO4·7H2O 0.020g/L,CH3COONa 2.000g/L,CaCl2·2H2O 0.010g/L,Trace 1mL。其他涉及培養(yǎng)基有以下三種。

        BBM培養(yǎng)基:NaNO3 0.250g/L,KH2PO4 0.175g/L,K2HPO4 0.075g/L,MgSO4·7H2O 0.075g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,NaCl 0.025g/L,Trace 1mL。

        DS培養(yǎng)基:NaNO3 0.300g/L,CO(NH2)2 0.150g/L,K2HPO4·3H2O 0.050g/L,F(xiàn)eC6H5O7 0.006g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,Trace 1mL。

        SE培養(yǎng)基:NaNO3 0.250g/L,K2HPO4·3H2O 0.075g/L,MgSO4·7H2O 0.075g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,KH2PO4 0.180g/L,NaCl 0.025g/L,F(xiàn)eCl3·6H2O 0.010g/L,F(xiàn)e-EDTA 1mL。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 CO2發(fā)生器的制作。取兩個2L的雪碧空瓶,并貼上A、B標(biāo)簽。A瓶裝200g檸檬酸加600mL水,B瓶裝200g小蘇打加300mL水,搖勻待用。然后取雙出口瓶蓋兩個,并貼上A、B標(biāo)簽。A蓋頂部一個口接壓力表,另一個口連接B蓋,下部接有通到瓶底的管子;B蓋一個口連接A蓋,其接口下部接有連接斜三角的管子(使其內(nèi)液體單向流動,即A瓶液體能進入B瓶,B瓶液體不能進入A瓶,且B瓶的氣體能進入A瓶),另一個口為出氣口,其上接有調(diào)節(jié)出氣量的閥門。

        接著蓋上瓶蓋,擠壓A瓶,使其內(nèi)檸檬酸進入B瓶與小蘇打反應(yīng);松開A瓶,B瓶氣體進入A瓶,所以兩瓶氣壓相等。重復(fù)擠壓幾次后,隨著小蘇打與檸檬酸反應(yīng),內(nèi)部氣壓升高,以致擠壓不動時,打開出氣口5s左右,使B瓶氣壓降低,A瓶的檸檬酸就會再次進入B瓶,關(guān)緊出氣口。搖晃B瓶,使其產(chǎn)生更多CO2,待壓力表上壓力為1.5左右時,出氣口接上通往培養(yǎng)器內(nèi)的管子即可。為了保證安全,在壓力表處接上自動泄壓閥,也可手動泄壓,防止瓶內(nèi)壓力過高。

        1.2.2 培養(yǎng)裝置的制作。光照:用8條LDE長條燈帶環(huán)繞在玻璃培養(yǎng)器周圍,頂部裝上吸頂燈環(huán)形替換光源。測得內(nèi)部光照強度大約為3 000lx。循環(huán):玻璃培養(yǎng)器內(nèi)部裝上兩個多功能潛水泵,提供內(nèi)部的水循環(huán),且保證一定的攪拌效果,防止過多的小球藻沉淀。通氣:外部裝上超靜音增氧泵和CO2發(fā)生器,通過橡膠管接入培養(yǎng)器內(nèi);每根橡膠管裝上止逆閥,防止內(nèi)部水倒流;培養(yǎng)器內(nèi)的橡膠管末端接上空氣細(xì)化器,使氣體均勻進入培養(yǎng)器。電源的接通:以上儀器均接于智能控制插座上,可自動控制以上儀器開啟和關(guān)閉的時間。氣密性檢查:開啟增氧泵,同時集氣口接上集氣袋,觀察集氣袋是否有氣體進入,正常進入即制作完成。

        1.2.3 培養(yǎng)基的選擇及改良。用250mL的三角瓶對本實驗室小球藻進行培養(yǎng)基的選擇及改良實驗。本實驗用BBM、DS、SE、HSM1四種培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻,對其生長情況及油脂積累情況進行比較,選出最優(yōu)。同時,用最優(yōu)培養(yǎng)基添加不同的植物激素2,4-D、6-BA 0.5mg/L,對其生長情況及油脂積累情況進行比較,選出最優(yōu)作為大容器培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

        1.2.4 菌種的活化。配制HSM1固體培養(yǎng)基20mL,然后和事先包扎好的10個平板一起放入滅菌鍋滅菌。滅過菌之后,在超凈工作臺中開始倒完平板,待平板凝固后拿出斜面保存著的菌種,進行四區(qū)劃線。最后,將劃好線的平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4~5d。

        1.2.5 種子液的配制。配制好HSM1培養(yǎng)基后,對其進行滅菌。滅完菌,待冷卻后,拿出之前活化好的平板,在超凈工作臺中,挑取單菌落接入錐形瓶里的培養(yǎng)基中。將接好的種子液進行光照培養(yǎng)4~5d。

        1.2.6 計數(shù)接種。對培養(yǎng)了5d的種子液進行計數(shù),并通過計算得出大約接種子液100mL,使得玻璃培養(yǎng)器中的含藻量為105個/mL。

        1.2.7 氣體的測量。用氣體收集袋收集培養(yǎng)器內(nèi)1min所排出的氣體,再利用排水法得出氣體的體積。CO2濃度的測量:用收集袋收集培養(yǎng)器內(nèi)的氣體,再用便攜紅外氣體分析儀測量收集袋中氣體的CO2濃度。根據(jù)氣體流量和通入氣體與流出氣體中CO2的濃度變化算出小球藻對CO2的去除量和去除率[5]。

        1.2.8 生物量的測定。濁度法:從玻璃培養(yǎng)器中取小球藻培養(yǎng)液,合理稀釋后在680nm下測定其光密度值,以O(shè)D680來衡量小球藻的相對生長量。

        鮮重法:在玻璃培養(yǎng)器充分?jǐn)嚢韬?,?00mL培養(yǎng)液,8 000r/min離心后將上清液倒掉,并將離心管倒置于報紙上,使其水分充分流失,稱重。

        1.2.9 回收及含油量的測定。將衰亡期的培養(yǎng)液進行沉淀、離心回收,并取10g的鮮菌于離心管中,加入6mol/L鹽酸6~8mL,用玻璃棒攪拌均勻,超聲波30min后放入沸水浴中水浴1d,取出放到冰中冷卻后,加入95%乙醇10mL,用力搖勻,置于冰浴中10min。向離心管中加入5mL石油醚(30~60),5mL乙醚搖勻,4 800r/min,離心4min,小心用吸管吸取醚層液,放入已知重量的試管中(重量記為[m1])。再加入3ml石油醚(30~60),3mL乙醚搖勻,4 800r/min,離心4min,小心用吸管吸取醚層液,放入同個試管中。在烘箱中由低到高逐漸升溫(不要暴沸),至85℃烘箱中干燥1h,取出冷卻稱重,直到達到恒重,重量記為[m2],既得小球藻油脂重(g)為[m=m2-m1],則可算得鮮菌的含油量。

        2 結(jié)果分析

        2.1 不同培養(yǎng)基對小球藻生長和油脂積累的影響

        在培養(yǎng)小球藻的過程中,培養(yǎng)基是否合適至關(guān)重要。因此,在大規(guī)模培養(yǎng)之前,要對培養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)基進行選擇優(yōu)化,選出最優(yōu)培養(yǎng)基,并將其改良成為適合本實驗的培養(yǎng)基,然后再開始進行實驗。小球藻L4在4種培養(yǎng)基BBM、DS、SE、HSM1中培養(yǎng),培養(yǎng)10d后小球藻的生長情況如圖1所示。圖1中OD680為原液稀釋10倍的數(shù)值。從圖1可以看出,以HSM1為培養(yǎng)基能使小球藻迅速生長,且具有較大的生物量。這可能與HSM1含有較大量的NH4Cl和CH3COONa有關(guān),NH4Cl為小球藻提供充足的氮源,而CH3COONa具有緩沖作用,防止培養(yǎng)基過酸而導(dǎo)致藻細(xì)胞大量死亡。

        小球藻L4在4種培養(yǎng)基BBM、DS、SE、HSM1中培養(yǎng),培養(yǎng)10d后小球藻的油脂積累情況如圖2所示。從圖2可以看出,以HSM1為培養(yǎng)基收獲的總油脂最多,這與其生物量大有關(guān)。因此,本實驗室保藏的小球藻適合生長于HSM1培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基能使小球藻在短時間內(nèi)快速生長,符合培養(yǎng)小球藻去除CO2的實驗要求,并能在后期提供生物精煉方向的研究。在以下所有實驗中均以HSM1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

        2.2 不同植物激素對小球藻生長和油脂積累的影響

        小球藻L4以HSM1培養(yǎng)基不加植物激素作為對照,添加植物激素6-BA、2,4-D培養(yǎng)10d,以100mL為培養(yǎng)單位的生長和油脂積累情況如表1所示。

        從表1可以看出,在添加2,4-D的培養(yǎng)基中,小球藻的鮮菌重最高,但含油量低;而在添加6-BA的培養(yǎng)基中,雖然鮮菌重比添加2,4-D的培養(yǎng)基低,但含油量高。這主要是因為生物柴油是最常用的生物燃料之一,被公認(rèn)為理想的可再生能源,因而也被看作為未來主要的能源來源。考慮到后期生物柴油方向的研究,選用HSM1添加植物激素6-BA為大容器培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

        2.3 大容器培養(yǎng)中小球藻的生物量變化

        在以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L為培養(yǎng)基,培養(yǎng)時持續(xù)通入CO2和空氣,通氣量為1L/min,CO2的濃度為6.56%,光照強度為3 000lx的大容器培養(yǎng)中,小球藻受多種因素的影響,因此,和錐形瓶培養(yǎng)的結(jié)果會有所不同。大容器培養(yǎng)中小球藻的生長情況如圖3所示。

        圖3中OD680為原液稀釋10倍的數(shù)值。從圖3可以看出,其延滯期比錐形瓶培養(yǎng)長了將近1d。因為通入CO2的原因,對數(shù)生長期生長情況優(yōu)于錐形瓶培養(yǎng)。但是,在第6天提前進入了穩(wěn)定期且OD680處于較低的狀態(tài),這可能與內(nèi)部水循環(huán)不充分有關(guān),導(dǎo)致藻體沉淀以及生長不良。

        2.4 大容器培養(yǎng)中小球藻對CO2的去除

        小球藻在生長過程中會進行光合作用,從而吸收CO2產(chǎn)生O2,達到去除CO2的目的。在120L的大容器培養(yǎng)中,在優(yōu)化的培養(yǎng)基中通入含6.56% CO2的空氣,通氣量為1L/min,觀察小球藻對CO2的去除情況,結(jié)果如圖4所示。

        圖4上是大容器中CO2濃度的變化情況,圖4下是CO2去除率的變化情況。從圖4可以看出,小球藻在延滯期及對數(shù)生長前期吸收的CO2小于放出的CO2,之后對CO2的去除與生長具有一定的相關(guān)性。在此培養(yǎng)器中,有一段時間會有陽光直射,內(nèi)部溫度可能會升高,使小球藻的呼吸作用加強。小球藻去除CO2的量最終會反映到生物量上來。隨著生物量的增加,顏色的加深,CO2的去除量及去除率逐漸與生長體現(xiàn)出相關(guān)性,培養(yǎng)8d時,去除率達到最高24.09%。最后,隨著小球藻生長速率減慢,對CO2的去除率逐漸降低。

        2.5 大容器培養(yǎng)中小球藻的回收及含油量

        因為小球藻具有多方面的價值,因而被廣泛應(yīng)用于美容、醫(yī)療保健、生物精煉等行業(yè)。在大容器培養(yǎng)中,小球藻的生物量達到一定程度且穩(wěn)定后,可對其進行回收利用,進行其他方面的檢測,從而充分體現(xiàn)小球藻的價值。培養(yǎng)10d,大容器中小球藻的生長已達到相對穩(wěn)定。生長情況如圖5所示。

        此時,生物量已達到穩(wěn)定水平。但是,由于光線原因看起來會是不均勻的,后期將對光照裝置進行改良。

        回收的方法是先關(guān)掉所有設(shè)備,使其沉淀2d,去除上清,留取約20L,取出用8 000r/min離心。此收集法獲得約200g鮮重,藻體含油量0.14g/L。小球藻藻體油滴的顯微拍照如圖6所示。

        在圖(b)中,紅色為葉綠素,黃色為生物柴油??梢姡笕萜髋囵B(yǎng)中小球藻的油脂較為明顯,可進一步改進提取油脂的方法。

        3 討論

        小球藻的生長繁殖快、抗逆性強、光合作用速率高、易于調(diào)控,適合用于生物工程技術(shù)方面的研究;同時,小球藻藻體具有很高的利用價值,具有較高的工業(yè)化潛力。因此,小球藻對CO2的固定有望成為一種可行性和經(jīng)濟價值較高的CO2固定方法。

        小球藻除了可應(yīng)用于CO2的固定外,因營養(yǎng)豐富,細(xì)胞壁極薄,易于消化吸收,在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也具有重要的經(jīng)濟價值;同時,小球藻的油脂含量高,微藻生物柴油是具有廣泛發(fā)展前景的生物柴油;在污水處理的研究中也有較大的進展等。

        本文的研究僅僅是初步探索大規(guī)模培養(yǎng)小球藻所面臨的一些問題,而要真正深入探究及解決所帶來的問題,還需要迎接巨大的挑戰(zhàn)。

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