李榮祥 劉成 黃嘉穗 宋果 唐小波

摘要：為加強(qiáng)高致病性禽流感的防控，采集了寧遠(yuǎn)縣某蛋雞場(chǎng)血樣，對(duì)（ H5+H7）二價(jià)滅活疫苗的抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明該蛋雞場(chǎng)免疫效果良好，（ H5+H7）二價(jià)滅活疫苗能提供有效保護(hù)。

關(guān)鍵詞：（ H5+H7）抗體水平;檢測(cè);雞

中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi：1 0.3969/j.issn.2096-3637.2019.17.005

0引言

高致病性禽流感病毒全稱禽類流行性感冒病毒，是由禽甲型流感病毒毒株引起的急性呼吸道傳染病，其中H5、H7是近年較流行且對(duì)人類健康及其生態(tài)環(huán)境造成巨大危害的疫病。為加強(qiáng)動(dòng)物H5、H7的防控，本文結(jié)合永州市寧遠(yuǎn)縣某蛋雞場(chǎng)實(shí)際情況，采用血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）方法對(duì)永州市寧遠(yuǎn)縣某蛋雞場(chǎng)（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)《永州市高致病性禽流感免疫計(jì)劃通知》[永牧辦發(fā)（ 2019）3號(hào)]相關(guān)規(guī)定，結(jié)果表明該蛋雞場(chǎng)免疫效果良好， （ H5+H7）二價(jià)滅活疫苗能提供有效保護(hù)。

1 材料

1.1被檢血清

被檢血清來(lái)自湖南省永州市寧遠(yuǎn)縣冷水鎮(zhèn)毛家村7組毛真斌蛋雞場(chǎng)，共10份。血清新鮮清亮，不溶血。

1.2檢測(cè)試劑

抗原選自哈爾濱國(guó)生生物科技有限公司，批號(hào)為201808150107，PBS緩沖液（PH 7.2，0.01mol/L）自配。

1.3器材

96孔V型（ 90°）微量反應(yīng)板、10～100uL單道及多道微量移液器（配有吸頭）、微量振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱等器材。

2方法與步驟

2.1血凝（HA）試驗(yàn)

H5、H7各設(shè)2排，96孔V型（90°）微量反應(yīng)板的1 ～12孔加入0.025 mL的PBS液;換新的滴頭，加入0.025mL抗原到第1孔吹吸混勻，對(duì)倍稀釋至第11孔。從第11孔吸入0.025 mL后棄去，換滴頭進(jìn)行下一步操作;1～ 12孔加入0.025 mL的PBS;1～12孔加入0.025 mL的1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液放置室溫充分混勻后再使用）。振蕩混勻1 ～2 min，室溫（20 ～ 25℃）下靜置25～ 30 min。對(duì)照孔紅細(xì)胞將成明顯的鈕扣狀沉到孔底后觀察結(jié)果。

2.2抗原回滴試驗(yàn)

H5、H7各設(shè)2排，每排設(shè)6孔;1～6列每孔加0.025 mL的PBS液;1-2列每孔加0.025 mL的4HAU病毒抗原，從第2列稀釋到第5列，第5列棄去。2～6列每孔補(bǔ)加0.025 mL的PBS;每孔加入0.025 mL的1%紅細(xì)胞懸液，震蕩搖勻1～2mm后靜置30 min，觀察結(jié)果。此試驗(yàn)主要是檢測(cè)4HAU抗原濃度是否配制正確。

2.3血凝抑制（HI）試驗(yàn)

微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025 mL的PBS，第12孔加入0.05 mL的PBS液;按順序從標(biāo)記好的樣本血清中吸取0.025 mL加入到第1孔吹洗混勻，倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025 mL棄去，換滴頭進(jìn)行下一步操作;1～11孔均加入4HAU已稀釋混勻的抗原液0.025 mL，在室溫（約20℃）靜置30～40 min后進(jìn)行下一步操作;1～12孔加入0.025 mL的1%的雞紅細(xì)胞懸液，置微量振蕩器上混勻約1～2 min，靜置約25～30 min（室溫20℃左右），對(duì)照孔出現(xiàn)明顯紐扣狀沉入孔底后觀察結(jié)果。

3注意事項(xiàng)

需嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件如控制紅細(xì)胞懸液和抗原工作濃度、試驗(yàn)溫度與其作用時(shí)間;應(yīng)使用pH值為7.0～7.2的PBS作稀釋液;配好后做抗原回滴試驗(yàn)確保濃度的準(zhǔn)確性;凍干抗原開(kāi)封溶解后，置-15℃冷凍保存，反復(fù)凍融應(yīng)不超過(guò)20次。2～8℃保存時(shí)會(huì)出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象。

4結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果紀(jì)錄如下：“#”表示凝集，“+”表示稍顯凝集者， “-”表示RBC沉于孔底：（不凝集）。血凝（ HA）效價(jià)：呈“#”凝集時(shí)的最高稀釋倍數(shù)為它的效價(jià)，此時(shí)的稀釋度為1個(gè)血凝單位，除以4即為含4HUA的抗原稀釋倍數(shù)。血凝抑制（ HI）效價(jià)：呈“-”完全抑制血凝的最高血清稀釋度為它的效價(jià)。由表1可知，H5 HA的最高稀釋倍數(shù)為第6孔、4HUA抗原稀釋倍數(shù)為1：16，H7 HA的最高稀釋倍數(shù)為第7孔、4HUA抗原稀釋倍數(shù)為1：32;由表2可知第3孔完全凝集，第4孔半流，抗原濃度配制正確。由表3可知，樣品H5 HI的效價(jià)均>26，由表4可知，樣品H7 HI的效價(jià)均>24。

5結(jié)論

根據(jù)《永州市高致病性禽流感免疫計(jì)劃通知》（永牧辦發(fā)[2019]3號(hào)）中規(guī)定，血凝抑制試驗(yàn)（HI）抗體滴度≥4log2判為合格;樣品H5 HI的效價(jià)均≥26，H7 HI的效價(jià)均≥24，均判為抗體陽(yáng)性，免疫效果良好，能提供有效保護(hù)。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：李榮祥（1963-），湖南寧遠(yuǎn)人，獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物養(yǎng)殖技術(shù)指導(dǎo)與疫病防控。

通信作者：宋果，研究方向：畜禽疫病的預(yù)防與診斷，郵箱：302609397@qq.com。