常新林 胡亞丹 鐘婷 李坤麗 張玉杰 孫振曉 楊潔 張園園

摘要? 目的：考察寒證大鼠肝臟細胞色素P450（CYP450）亞酶的表征特點及熱性中藥的調(diào)控效果。方法：選取知母-石膏-黃柏-龍膽草制備寒性造模藥，對SD大鼠誘導(dǎo)21 d后復(fù)制寒證模型;另取肉桂提取物對寒性大鼠進行干預(yù)，制備觀察組;用生理鹽水處理為對照組。鈣鹽沉淀法制備肝臟微粒體，與混合探針藥物溫孵，用高效液相色譜（HPLC）法測定探針藥物的代謝消除百分率，評價CYP450亞酶活性變化。提取肝臟總RNA，實時熒光定量PCR法測定CYP450亞酶的mRNA表達。結(jié)果：寒性中藥對大鼠CYP3A1酶的活性和mRNA具有顯著的抑制作用，熱性肉桂具有一定的調(diào)控作用，并且這種調(diào)控發(fā)生在mRNA水平。結(jié)論：本研究從多角度系統(tǒng)評價和驗證寒證機體CYP450亞酶的表征特點及熱性中藥的調(diào)控效果。

關(guān)鍵詞? 寒證;大鼠;肉桂;細胞色素P450;Cocktail探針法;mRNA;造模;調(diào)控

Characterization of CYP450s in Cold Syndrome Rats and the Regulative Effect of Cinnamomum Cassia

Chang Xinlin，Hu Yadan，Zhong Ting，Li Kunli，Zhang Yujie，Sun Zhenxiao，Yang Jie，Zhang Yuanyuan

（School of Chinese Materia Medica，Beiing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Abstract Objective： To study the characterization of five kinds of CYP450 in the liver of cold syndrome rats and the regulative effect of heat traditional Chinese medicine. Methods： Cold syndrome model was induced in SD rats for 21 days by gavage of Anemarrhena asphodeloides-Gypsum Fibrosuum-Cortex Phellodendri-Gentiana scabra.In addition，cold syndrome rats were treated with Cinnamomum cassia extract to prepare the treatment group.Saline was used as the control medicine.The liver microsomes were prepared by calcium precipitation method，incubated with mixed probe drugs，and the percentage of metabolic elimination of the probe drugs was determined by HPLC method to evaluate CYP450 activity.Total RNA was extracted from the liver and mRNA expression of CYP450s was determined by real-time fluorescent quantitative PCR. Results： The cold medicine can inhibit the activity and mRNA of CYP3A1 in rats.Cinnamomum cassia has a certain regulative effect which took place at mRNA level. Conclusion： This study should be further combined with protein expression experiments to evaluate and verify the characteristics of CYP450 enzyme in cold syndrome and the regulation effect of heat traditional Chinese medicine from multi-angle system.

Key Words? Cold syndrome; Rat; Cinnamomum cassia; CYP450; Cocktail probe method; mRNA

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.015

中藥藥性理論是中醫(yī)藥基本理論之一，寒熱藥性理論是其基礎(chǔ)和核心。以偏糾偏是藥物治療作用的本質(zhì)所在，即“熱者寒之、寒者熱之”?，F(xiàn)代基因技術(shù)、代謝組學(xué)和藥物動力學(xué)等研究表明，寒、熱證候下機體的代謝網(wǎng)絡(luò)明顯偏離正常，而經(jīng)中藥干預(yù)后模型動物的代謝譜回歸至正常范圍，呈現(xiàn)一定的網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的效果[1-4]。細胞色素P450酶（CYP450酶）為機體代謝網(wǎng)絡(luò)中最重要的功能蛋白，是機體內(nèi)、外源小分子物質(zhì)代謝的主要承擔(dān)者，在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、代謝對機體有害的物質(zhì)和免疫方面發(fā)揮著重要作用[5]。研究表明，熱證（寒證）下，機體腎上腺皮質(zhì)激素、性激素等類固醇激素，膽固醇、脂肪酸等內(nèi)源性物質(zhì)代謝異常[6-9]，CYP450酶作為直接參與上述物質(zhì)代謝的功能蛋白[10]，其表達水平的特異性改變將反映熱證（寒證）下機體代謝網(wǎng)絡(luò)特點。另有研究報道配伍熱性藥后，寒性藥對CYP450酶的抑制作用得到調(diào)控[11-12]。我們選取肝臟中含量較高的5種CYP450亞酶，以寒證模型大鼠為載體，采用熱性中藥肉桂進行干預(yù)，從酶的活性和mRNA表達水平考查寒證機體CYP450酶的表征特點及熱性中藥的調(diào)控效果，考察CYP450酶與中藥藥性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取雄性Sprague-DawLey（SD）大鼠24只，體質(zhì)量（200±10）g，購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號SCXK（京）2012-0001。大鼠于實驗室常規(guī)飼養(yǎng)，實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.1.2 藥物 肉桂、知母、石膏、黃柏、龍膽草藥材購自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王學(xué)勇教授鑒定。

1.1.3 試劑與儀器 探針藥物美托洛爾（CYP2D1底物）、氨苯砜（CYP3A1底物）、非那西丁（CYP1A2底物）、氯唑沙宗（CYP2E1底物）、甲苯磺丁脲（CYP2C11底物），內(nèi)標五味子醇甲，NADPNa2，D-葡萄糖-6-磷酸二鈉、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、考馬斯亮藍G-250均購于Sigma公司;乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher）;引物、RT試劑、熒光定量PCR試劑、sybr greenI均購自ShineGene公司。LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津），F(xiàn)TC2000熒光定量PCR儀（加拿大Funglyn Biotech）;GL-21M高速冷凍離心機（上海盧湘儀）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用水煎法制備。分別稱取造模用（知母-生石膏-黃柏-龍膽草1.5∶ 2∶ 1∶ 1）[13]、治療用（肉桂）藥材，8倍量水浸泡1 h，回流提取1 h，濾過后用6倍量水回流提取30 min，2次藥液合并，減壓濃縮至造模用藥液濃度為1 g生藥/mL，低劑量觀察組藥液濃度為1 g生藥/mL，高劑量觀察組藥液濃度為3 g生藥/mL。

1.2.2 給藥方法 采用造模藥復(fù)制熱證模型，每鼠每日上午灌胃給予4 mL造模用藥液，連服21 d;正常對照組給予等體積生理鹽水。第8天起每日下午，觀察組分別灌胃給予相應(yīng)的藥物治療（10 mL/kg），模型對照和正常對照組給予生理鹽水（10 mL/kg），連續(xù)14 d。大鼠末次給藥后2 h腹腔注射25%的烏拉坦麻醉處死，取肝組織剪碎、漂洗、吸干，-80 ℃保存。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 Cocktail實驗

1）大鼠肝微粒體的制備 取大鼠肝組織，按1∶ 3的比例加入KCL緩沖液，勻漿。將勻漿液于4 ℃，4 500 r/min離心20 min，再取上清液與88 mmol/L CaCl2溶液混勻，使終濃度為8 mmol/L，冰浴5 min，再于4 ℃，13 000 r/min，離心20 min，用KCl緩沖液洗滌沉淀1次，所得微粒體以Tris-蔗糖緩沖液（pH7.4）混懸，-80 ℃保存[14]。

2）溫孵條件及樣品處理 精密量取各探針藥物溶液于PE管中，氮氣吹干，加入200 μL大鼠肝微粒體蛋白（2 mg/L），于37 ℃水浴均勻振蕩3 min，加入200 μL NADPH-發(fā)生系統(tǒng)，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min后立即按1∶ 3的比例加入冰甲醇終止反應(yīng)，加入20 μL 0.06 mg/mL內(nèi)標，于4 ℃，6 000 r/min，離心20 min。取上清液氮氣吹干，甲醇溶解后用高效液相色譜（HPLC）法分析。

3）HPLC實驗 迪馬C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），（NH4）2HPO4緩沖鹽（A，pH 3.6），乙腈（B）梯度洗脫，程序如表1，流速：1.0 mL/min，柱溫：40 ℃，檢測波長230 nm。色譜圖如圖1所示?？梢?種探針藥物與內(nèi)標物峰形良好，空白肝微粒體實驗也未見干擾，方法專屬性強。

用HPLC法測定各探針底物濃度，計算代謝消除百分率。公式如下：

探針底物代謝消除百分率（%）=???? 加入探針底物的量-測得探針底物的量 加入探針底物的量 ×100

1.2.3.2 實時熒光定量PCR

1）RNA的提取與鑒定 取剪碎的肝組織，每50～100 mg加入1 mL TRIzol試劑，按試劑說明書進行提取，將提取的RNA溶解于適量無RNase水中?？瞻捉MA260/A280=1.97;實驗組A260/A280的結(jié)果介于1.8～2.0，即沒有殘余蛋白，RNA純度較高（圖2）。

2）逆轉(zhuǎn)錄? 配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（總體積20 μL），其中含2×RT buffer 10 μL、6N隨機引物（100 pmol/μL）1 μL、RT-mix 1 μL、模板（RNA）5 μL、DEPC水3 μL。反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。

3）熒光定量PCR 對Cocktail法檢測到有活性改變的3種亞酶進行mRNA水平檢測。PCR反應(yīng)體系（總體積50 μL）中包含2×PCR buffer 25 μL、Primers（25 pmol/μL）2 μL、Sybr green I（20 pmol/μL）0.5 μL、模板（cDNA）2 μL、DEPC水20.5 μL。擴增條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，退火溫度為60 ℃ 30 s，72 ℃30秒循環(huán)35次，72 ℃檢測信號。以β-actin為內(nèi)參基因，進行PCR擴增產(chǎn)物的實時定量分析，用2-△△CT方法分析mRNA的表達。檢測的CYP450亞酶及特異性引物序列見表2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 9.3統(tǒng)計軟件處理。代謝消除百分率以均值±標準差（? ±s ）表示，組間平均值比較采用LSD-t檢驗，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP450亞酶的活性 與空白組比較，寒性造模藥物可非常顯著抑制CYP3A1、CYP1A2的活性。治療后，肉桂高劑量組對寒證大鼠CYP3A1的活性有非常顯著的上調(diào)趨勢，肉桂高、低劑量組對寒證大鼠CYP1A2的活性都有顯著上調(diào)作用。對于CYP2E1，寒性中藥對大鼠肝微粒體該酶活性無顯著影響，給予高劑量肉桂后，酶活性被誘導(dǎo)。而CYP2D1和CYP2C11活性未受藥物影響。見表3。

2.2 CYP450亞酶的mRNA表達 表明在mRNA水平，寒性大鼠CYP3A1的表達也被顯著抑制。給予熱性藥肉桂后，寒證大鼠CYP3A1的mRNA表達上調(diào)。而給藥組CYP1A2、CYP2E1的mRNA與空白組無差異，即酶活性改變的機制不是發(fā)生在mRNA水平。見表4。

3 討論

CYP450酶為體內(nèi)最重要的代謝酶，僅CYP2D6、CYP3A、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19五種亞酶就參與了90%的藥物代謝[15]，其在大鼠體內(nèi)的同源蛋白分別為CYP2D1、CYP3A1/2、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C11。其中CYP3A是人體內(nèi)表達最豐富的CYP450酶，在藥物代謝中發(fā)揮絕對重要的作用，可代謝進50%的藥物。本研究表明，寒性中藥對大鼠CYP3A1酶的活性和mRNA具有顯著的抑制作用，熱性肉桂具有一定的調(diào)控作用，并且這種調(diào)控發(fā)生在mRNA水平。

本研究選取Cocktail探針藥物法考查酶活性，從而探討寒證機體CYP450酶的表征特點及熱性中藥的調(diào)控效果，方法的優(yōu)點在于可以在單個試驗過程獲得多個代謝途徑的信息，從而真實地反映出藥物對CYP450不同亞型代謝酶的影響，此外，該方法受個體間的差異影響也比較小，省時經(jīng)濟、簡便靈敏。

藥物對CYP450酶活性的影響機制包括酶的基因表達、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平等多方面。只有CYP450同工酶的活性、蛋白水平和mRNA水平都降低（升高）才表明該酶被抑制（誘導(dǎo)）[16]。因此，本研究要進一步結(jié)合蛋白表達實驗，從多角度系統(tǒng)評價和驗證寒證機體CYP450酶的表征特點及熱性中藥的調(diào)控效果。

參考文獻

[1] 王米渠，馮韌，嚴石林，等.基因表達譜芯片與中醫(yī)寒證的7類相關(guān)基因[J].中醫(yī)雜志，2003，44（4）：288-289.

[2]馮韌.用基因芯片研究熱藥治療寒證的差異基因表達譜[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2004.

[3]周紅光.代謝組學(xué)在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（9）：101-104.

[4]陳爍，王秀鳳.腎陽虛證代謝組學(xué)研究進展[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報，2015，31（6）：829-832.

[5]Slaughter RL，Edwards DJ.Recent advances：the cytochrome P450 enzymes [J].Ann Pharmacother，1995，29（6）：619-624.

[6]王子晨，張建軍，朱映黎，等.阿薩伊對虛熱和虛寒證大鼠的脂肪代謝、免疫物質(zhì)和內(nèi)分泌激素的影響[J].中國中藥雜志，2017，42（13）：2552-2557.

[7]秦路平，張漢平，張衛(wèi)東，等.蛇床子素和蛇床子總香豆素對腎陽虛大鼠血清甲狀腺激素和促甲狀腺激素的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（9）：552-553.

[8]成秀梅，杜惠蘭，路帥，等.寒凝血瘀模型大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化及其對生殖內(nèi)分泌的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，35（10）：670-672.

[9]閆波，孫國祥，孫萬陽，等.中藥寒熱溫涼四性研究方法與思路[J].中南藥學(xué)，2016，6（6）：572-580.

[10] 趙陽陽，許智慧，劉妍，等.細胞色素P450 基因多態(tài)性與藥物代謝研究進展[J].臨床藥物治療雜志，2017，14（4）：6-11.

?[11] 田義超，周靜，徐凌云.銀杏內(nèi)酯B注射液對大鼠體外肝微粒體CYP1A2活性的影響[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2014，30（3）：204-207.

[12]奚麗君.以半夏藥對研究七情配伍對細胞代謝酶P450 的影響[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[13]梁月華，李薪萍，任紅.寒證熱證時中樞、內(nèi)臟、尿內(nèi)兒茶酚胺及5-羥色胺的變化[J].中醫(yī)雜志，1991，32（12）：38-40.

[14]韋靈玉，張玉杰，魏寶紅，等.黃連黃芩及配伍誘導(dǎo)對大鼠肝微粒體5種CYP450 亞酶活性的影響[J].中國中藥雜志，2013，38（9）：1426-1428.

[15]愛德華.類藥性質(zhì)—概念、結(jié)構(gòu)設(shè)計與方法，從ADME到安全性優(yōu)化[M].鐘大放譯.北京：科學(xué)出版社，2011：186.

[16]陳西敬.藥物代謝動力學(xué)研究進展[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：100.