徐重新　劉敏　張霄　劉媛　張存政　劉賢金

摘要：農(nóng)藥殘留是威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的關鍵危害因素之一，是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作的重要對象。當前已被開發(fā)和投入使用的農(nóng)藥種類紛繁復雜，農(nóng)藥殘留檢測工作任務多、責任大，因此建立一套可用于農(nóng)藥殘留檢測用的免疫學快速檢測方法一直是廣大科研工作者努力探索的目標。本文分門別類梳理農(nóng)產(chǎn)品中主要農(nóng)藥殘留及其危害，探討國內(nèi)外抗體創(chuàng)制領域最新熱點技術，并就農(nóng)藥殘留檢測用廣譜特異性抗體研發(fā)和應用現(xiàn)狀進行概述及展望，旨在為指導農(nóng)藥殘留快速檢測技術的研發(fā)提供參考。

關鍵詞：農(nóng)產(chǎn)品;農(nóng)藥殘留;廣譜特異性抗體;檢測方法

中圖分類號：TS207.5*3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0489-08

農(nóng)藥作為當今世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可或缺的重要生產(chǎn)資料，主要用于防控病蟲害、雜草及鼠類等，有效保障了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，帶來了巨大的社會和經(jīng)濟效益”。同時，也因為農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的大量使用，其在農(nóng)產(chǎn)品、水及土壤環(huán)境中的殘留，給生態(tài)環(huán)境造成了巨大的負面影響，嚴重威脅人及動物健康[23]。近年來農(nóng)藥引發(fā)的影響較大的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全事件也時有發(fā)生，如2010年海南“毒豇豆”事件、2013年山東濰坊“毒生姜”事件等，導致多名消費者中毒，影響較大，嚴重挫傷廣大消費者對中國農(nóng)產(chǎn)品的消費信心[4]。農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)供過程的用藥安全關系到廣大老百姓的日常生活，是關乎國計民生的大事，黨中央和國務院各有關職能部門高度重視。習總書記2013年在中央農(nóng)村工作會議上就提出農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全是“產(chǎn)出來”與“管出來”的重要論斷，要求以“四個最嚴”確保廣大老百姓“舌尖上的安全”;2016年12月原國家衛(wèi)計委、農(nóng)業(yè)部和食藥總局聯(lián)合發(fā)布了食品安全國家標準《食品中農(nóng)藥殘留最大限量》（GB2763-2016），規(guī)定了中國食品中433種農(nóng)藥4140項最大殘留限量指標，配套的檢測方法接近1000個;與此同時，新修訂的《食品質(zhì)量安全法》和《農(nóng)藥管理條例》已分別在2015年10月1日和2017年6月1日正式頒布實施，《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》也在著手修訂當中[5]。農(nóng)藥殘留監(jiān)測作為農(nóng)產(chǎn)品準入市場前的最后一道工序，是保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的最后一道防線。當前農(nóng)藥殘留檢測分析方法主要分為高精度的儀器分析法[氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣相/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC/HPLC-MS）]和快速檢測法（免疫分析法、酶抑制法、生物傳感器法、活體檢測法和液體工作站檢測法等）[6]。眾多方法中，基于“抗原-抗體”結(jié)合原理的免疫學檢測方法因其具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、方便快捷、分析容量大等特點，適用于現(xiàn)場樣品分析和大容量樣品檢測，是農(nóng)藥殘留檢測的研究熱點刀。同時，很多類型的農(nóng)藥都具有通用結(jié)構或共性區(qū)域等特點[8]，這也為農(nóng)藥檢測用廣譜特異性抗體提供了依據(jù)和可能，本文著重就廣譜檢測用抗體在農(nóng)藥殘留檢測上的研究及應用狀況進行概述。

1 當前農(nóng)藥使用狀況及其主要殘留風險

農(nóng)藥作為用于防控農(nóng)林病蟲害及雜草和調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長的藥品的統(tǒng)稱，其具有來源廣、品種多、成分復雜等特點，是當今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的投入品，為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)保收做出了巨大貢獻[9]。與此同時，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對農(nóng)藥的過渡依賴，長期大量使用農(nóng)藥（特別是化學農(nóng)藥）導致農(nóng)藥殘留、土壤功能退化、水體和環(huán)境污染、生物鏈結(jié)構中斷以及生態(tài)失衡等一系列問題日益凸顯[2.10]。有證據(jù)表明，相當一部分化學農(nóng)藥對人畜具有高“三致”（致癌、致畸、致突變）危害風險，越來越引起科學界和政府部門的高度關注[11-12]。按來源可將農(nóng)藥劃分為無機農(nóng)藥（砷酸類、氯酸類、硫酸銅等有毒有害無機物）、有機合成農(nóng)藥（有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類、三嗪類和新煙堿類等合成農(nóng)藥）和生物農(nóng)藥（微生物農(nóng)藥、植物和動物等代謝產(chǎn)物或提取物以及轉(zhuǎn)基因生物毒素）等三大類。本文按類別劃分，整理了幾種較為典型的代表性農(nóng)藥的主要用途、危害風險及其每日允許攝入量等信息（表1）。

無機農(nóng)藥主要是源于天然的無機類化學物或其制劑，在早期農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用，然而隨著科技的發(fā)展，其多數(shù)品種因具有毒性強、安全性差、藥效欠佳及使用量大等缺點，逐漸被淘汰，其中汞制劑、砷鉛類等早已被列入國家禁用農(nóng)藥名錄[13]。有機氯農(nóng)藥[如DDT（Dichlo-rodiphenyltrichloroethane）、六六六（Hexachlorocy-clohexane）、艾氏劑（Aldrin）等]主要以苯、環(huán)戊二烯以及松節(jié)油為原料，結(jié)構穩(wěn)定，不易降解，具有持久性、遠距離遷移性、生物蓄積性等特點，能引起人畜慢性中毒，目前有機氯農(nóng)藥已經(jīng)在世界范圍內(nèi)開始被陸續(xù)禁止生產(chǎn)和使用[14]。有機磷農(nóng)藥多數(shù)屬于磷酸酯類或硫代磷酸酯類化合物，其殘留引發(fā)的中毒特征主要是導致神經(jīng)系統(tǒng)機能失調(diào)，引發(fā)身體不良狀況，中國農(nóng)藥食物中毒事件中有機磷農(nóng)藥高居首位，其中甲胺磷（Methami-dophos）、對硫磷（Parathion）、毒死蜱（Chlorpyri-fos）、甲拌磷（Phorate）等已被列入國家禁用農(nóng)藥名錄[15-1]。擬除蟲菊酯（Pyrethroid）是由天然除蟲菊素改變結(jié)構后發(fā)展而來，是一類類似于天然除蟲菊素（Pyrethrin）的有機化學合成物（如高效氯氟氰酯、順式氯氰菊酯、順式氰戊菊酯等），因其對作物和多種害蟲具有高選擇性、高效率、低毒性、快速殺蟲和殘留少等優(yōu)點，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)了較大市場份額，但菊酯類農(nóng)藥對水生生物具有特異性高毒活性，因而嚴重威脅水生生物群落平衡[17-18]新煙堿類有機農(nóng)藥也是近年來蓬勃發(fā)展的人工合成的超高效殺蟲劑[如啶蟲瞇（Acetamiprid）、噻蟲胺（Clothianidin）、吡蟲啉（Imidacloprid）、噻蟲啉（Thiacloprid）等]，具有廣闊的發(fā)展前景，對昆蟲具有高殺蟲活性，而對人及哺乳動物低毒，屬于安全農(nóng)藥[19]。生物農(nóng)藥是非化學合成的天然生物源化合物，具有類似農(nóng)藥的作用，主要來源于生物活體或其代謝產(chǎn)物[如當前使用較為成熟的有蘇云金芽孢桿菌Bt毒素（Bacillus?thuringiensis，Bt）、2，4-D（2，4-Di-chlorophenoxyacetic acid）、沙蠶毒素（Lumbriconer-is heteropoda）、阿維菌素（Abamectin）等]，一般認為其具有對人畜和非靶標生物安全、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗性、易于保護生物多樣性等優(yōu)點，對人類健康、環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都有重大的意義[2[20]，但近年也不斷暴露出一些安全隱患，引起關注[21-23]。

2 抗體的發(fā)展及其創(chuàng)制技術

抗體（Antibody，Ab）又稱為免疫球蛋白（Immu-noglobulin，Ig），是當今生物醫(yī)藥、生命科學基礎研究以及免疫學診斷、分析與快速檢測等研究領域最熱門、使用最廣的蛋白質(zhì)材料[2425]。自1890年德國科學家首次證實在免疫動物的血清里有免疫球蛋白存在，隨后抗體結(jié)構與功能被不斷研究、挖掘和利用，并逐漸發(fā)展成為一門全新的熱門學科一免疫學（Immunology），到目前為止，抗體制備技術已經(jīng)從第一代的多克隆抗體（Polyclonal antibody，PAb）制備，第二代的單克隆抗體（Monoclonal antibody，MAb）制備發(fā)展到了第三代全新的基因工程抗體（Genetic engineering antibody，GEAb）創(chuàng)制階段[26]，多克隆抗體是天然抗原經(jīng)不同途徑免疫動物產(chǎn)生的多種抗體的混合物，其制備過程簡單，生產(chǎn)成本低，無需特殊的儀器設備，而且親和力普遍較一般的單克隆抗體高，所以目前仍是抗體制備研究領域最為經(jīng)典和普及的首選方法;然而其存在抗原結(jié)合特異性不強、效價低、數(shù)量有限、難以重復制備、不利于批量生產(chǎn)等不可避免的缺陷[27]。目前多克隆抗體主要通過免疫兔、羊、鼠等動物，采集其血清并經(jīng)純化（包括飽和硫酸銨鹽析、柱親和層析及吸附法等）獲得純度較高的抗體蛋白[26]。單克隆抗體是Kohler和Milstein在1975年發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)制的純單一性抗體，具有抗原特異性和較高親和力的特點，由此從根本上解決了傳統(tǒng)多克隆抗體存在的抗原特異性和可重復性等問題，是抗體制備技術領域標志性的突破，其在生物醫(yī)藥領域的應用價值尤為凸顯，現(xiàn)已獲批準上市的單抗類藥物有近50種，且還有近300種已經(jīng)進入臨床試驗階段[28-29]。目前制備的單克隆抗體以鼠源抗體居多，但單克隆抗體也存在制備周期長、過程繁瑣、專業(yè)技術要求高、制備條件苛刻以及雜交瘤細胞傳代退化等缺點[28]?；蚬こ炭贵w興起于20世紀80年代，是伴隨分子生物學、分子免疫學等學科飛速發(fā)展而來的一項在分子水平對抗體基因進行剪接修飾及表達與篩選的基因工程人工新型抗體創(chuàng)制技術[30]。Morrison等[31]在1984年首次報道人-鼠嵌合體在骨髓瘤細胞中成功表達，并結(jié)合Smith等[32]發(fā)明的噬菌體表面展示技術，從而催生出了噬菌體表面展示抗體庫技術，由此拉開了人工基因工程抗體創(chuàng)制技術的序幕，抗體就此擺脫動物免疫過程并進入能定向進化成熟的新階段。目前基因工程抗體類型主要有人源化修飾抗體（如人鼠嵌合抗體）、單鏈抗體（如劍橋大學蛋白質(zhì)工程中心推出的Tomlinson I+J庫）、單域抗體或納米抗體（如駝源單域抗體，VHH）和隨機多肽抗體（如NEB公司推出的七肽庫、十二肽庫）等，此外還有Fab抗體、二硫鍵穩(wěn)定抗體、雙特異性抗體等衍生抗體3333目前可用于基因工程抗體展示表達的載體主要可以分為噬菌體表面展示系統(tǒng)、核糖體展示系統(tǒng)、酵母展示系統(tǒng)、細菌展示系統(tǒng)、桿狀病毒展示系統(tǒng)以及哺乳細胞展示系統(tǒng)等，其中以噬菌體表面展示抗體研究最早技術最成熟、普及最廣、應用最成功，也最為人們所關注[3536]。噬菌體抗體是集抗體的表型與基因型于同一個噬菌體上，通過抗原固相篩選，從庫中獲得抗原特異性抗體的同時也獲得其基因，這樣極大方便了抗體進一步定向成熟結(jié)構分析以及多宿主轉(zhuǎn)移表達和大量制備等3738]。以噬菌體表面抗體展示技術為代表的新型基因工程抗體創(chuàng)制技術，有效避免了免疫及雜交等繁雜過程，使得抗體制備更方便、更省時、更省力，具備自動化高通量篩選和制備特異性抗體的優(yōu)勢，是當今抗體創(chuàng)制研究領域發(fā)展最具潛力的技術。

3 廣譜特異性抗體創(chuàng)制策略及其在農(nóng)藥殘留檢測上的應用

農(nóng)藥雖然來源廣、成分復雜、結(jié)構多樣，但針對其殘留檢測的免疫學檢測方法卻大同小異，都是依托制備具有識別多種農(nóng)藥成分的廣譜特異性抗體，然后建立免疫學檢測方法。依據(jù)農(nóng)藥共性結(jié)構或化學基團制備針對農(nóng)藥廣譜檢測用的抗體，是當前農(nóng)藥殘留檢測免疫分析最主要的方式（表2）。針對小分子農(nóng)藥，大多數(shù)都是根據(jù)其類別的共性結(jié)構或化學基團來設計、合成與母體結(jié)構密切相關的類似物作為通用性半抗原，然后以半抗原為免疫或包被抗原，制備或篩選廣譜特異性抗體[8]。文孟棠等[39]以擬除蟲菊酯通用結(jié)構間苯氧基苯甲酸（PBA）為半抗原，免疫制備了具有同時識別4種菊酯類農(nóng)藥的單克隆抗體，檢測靈敏度在0.24～1.80 mg/L;Zhao等[40]以同樣的半抗原為包被抗原，從噬菌體抗體庫中成功篩選到具有識別多種菊酯農(nóng)藥的單域抗體，檢測靈敏度在0.33～0.86 μg/ml，并建立檢測方法用于實際樣品添加回收檢測。梁穎等[41]和賀江等[42]以甲氧基有機磷類農(nóng)藥通用結(jié)構0，0-二甲基硫代磷酸酯（GMP）為半抗原，分別獲得了具有同時識別馬拉硫磷、稻豐散、樂果、亞胺硫磷等農(nóng)藥的廣譜多克隆抗體和人源單鏈抗體。此外，根據(jù)通用半抗原結(jié)構，Wang等[43]制備了二乙氧基有機磷類農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，Eugenia等[4制備了氨基甲酸酯類農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，王升吉等[45]制備了2，4-D類農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，Wang等[46]制備了阿維菌素類農(nóng)藥廣譜單克隆抗體。大分子農(nóng)藥的殘留免疫檢測用廣譜特異性抗體主要依據(jù)其三維結(jié)構或者氨基酸序列相似的特點免疫制備或靶向庫篩選獲得[47]。Dong等[48-49]和Xu等[50]通過三維結(jié)構分析，發(fā)現(xiàn)BtCry類生物農(nóng)藥Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F等毒素蛋白的DomainI區(qū)氨基酸和三維結(jié)構具有高度同源性和相似性，并以此為依據(jù)通過設計分別成功制備或篩選到了具有識別多種Cry毒素的單克隆抗體和單域抗體，建立的免疫學分析方法可用于實際樣品添加回收檢測。此外針對特異性農(nóng)藥類別的殘留檢測，也有采用制備決定簇人工抗原[51]、雜交-雜交瘤抗體[52]以及基因工程抗體的特性改造[53-54]等方式的報道。

4 展望

總的來說，目前廣譜特異性抗體在農(nóng)藥殘留檢測上的應用還處于實驗室研究和初步探索階段，成熟的商品化產(chǎn)品很少，抗體材料和相應的快速檢測技術還需進一步加快研究步伐。就抗體材料創(chuàng)制來說，目前傳統(tǒng)多克隆抗體、單克隆抗體仍然是農(nóng)藥殘留免疫學檢測的主流，抗體親和活力相對穩(wěn)定、有保障，但從目前發(fā)展趨勢來看，基因工程抗體在不久的將來必將取代傳統(tǒng)多克隆抗體、單克隆抗體用于免疫檢測技術研發(fā)，不過其前提是基因工程抗體親和活力定向成熟技術要有實質(zhì)性的突破，目前定點突變（Site-directed mutagenesis）、易錯PCR（Error PCR）、鏈置換（Chain shuffling）、DNA改組（DNA shuffling）等可用于抗體親和力改造的技術多數(shù)處于理論階段[65]。就免疫學檢測方法來說，目前最為常見的是ELISA法，其基于HRP顯色從而間接反映檢測物的存在與否，一般對檢測物的可分辨靈敏性不高，這樣極大限制了抗體的廣譜識別能力;為提高既有抗體的檢測}靈敏度從而擴大抗體對農(nóng)藥的廣譜識別能力，可以大力發(fā)展時間分辨熒光免疫分析技術（如抗體標記非放射性稀土離子），如此達到進一步提高抗體對農(nóng)藥的檢測靈敏度（可達1000倍以上）的目的[66]

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