馮磊　石元豹　汪貴斌　曹福亮

摘要：以銀杏基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行篩選和分析，從銀杏基因組中鑒定出72條bHLH轉(zhuǎn)錄因子。進一步分析發(fā)現(xiàn)，不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子序列長度和分子量差異較大，而理論等電點及親水性等比較接近;各家族成員均含有N端堿性氨基酸區(qū)和C端的螺旋環(huán)螺旋區(qū);該家族可分為17個亞家族，相同亞家族成員保守基序的類型十分相似。通過啟動子分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)銀杏bHLH基因啟動子均含有光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件等。表達分析結(jié)果顯示，有7條銀杏bHLH基因的表達具有組織特異性，有6條基因在各組織中表達水平都比較高，預(yù)測其在銀杏生物學(xué)過程中具有十分重要的作用。

關(guān)鍵詞：銀杏;bHLH轉(zhuǎn)錄因子;進化分析;表達分析

中圖分類號：S792.95

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0400-12

bHLH（Basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子是廣泛存在于動、植物中的轉(zhuǎn)錄因子超家族，因其“堿性螺旋-環(huán)-螺旋”保守結(jié)構(gòu)域而命名[1]。鳥類成髓細胞癌病毒中的c-MYC原癌基因是第1個被發(fā)現(xiàn)的bHLH家族成員基因[2]，之后該類型的基因又陸續(xù)在多種動、植物中被發(fā)現(xiàn)[3]。該家族蛋白質(zhì)的bHLH保守結(jié)構(gòu)域大約含有60個氨基酸，其堿性區(qū)域分布在多肽鏈的N端，并負責(zé)與特定DNA的順時作用元件結(jié)合;HLH區(qū)域位于C末端，參與二聚體或者異二聚體的形成，從而行使其功能。

動物中bHLH家族數(shù)量較多，被分為A～F等6個組，共計45個家族[4]。與動物相比，植物中bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子相對較少，而且大多數(shù)植物的bHLH蛋白在動物的該家族分類中屬于B組[5]，根據(jù)植物中bHLH蛋白的序列同源性，又可將其分為不同的亞家族[5-6]。到目前為止，擬南芥中已鑒定的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子有162種，并且與水稻中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子一起被分成了25個亞家族[7-9]。有學(xué)者對擬南芥、毛果楊、水稻、小立碗蘚以及5種藻類的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行綜合分析，并將其分成32個亞家族[10]。隨著二代和三代測序技術(shù)的發(fā)展，蘋果梨、櫻桃、西瓜、甘薯、大白菜等越來越多植物的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來[11-17]。

植物中bHLH家族不但數(shù)量較多，還參與植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫和次生代謝調(diào)控等多種生物學(xué)過程[18-19]。近年來，植物bHLH家族蛋白質(zhì)的功能研究已經(jīng)成為熱點并且得到了快速發(fā)展。擬南芥作為模式植物，其bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能研究相對較多。有研究者發(fā)現(xiàn)AtbHLH112對抗鹽、抗旱和抗?jié)B透脅迫有正調(diào)控作用，但是對擬南芥根系的發(fā)育有抑制作用[2021]。FIT轉(zhuǎn)錄因子可與At-bHLH38和AtbHLH39 共同調(diào)控擬南芥的鐵代謝[2]。光敏色素作用因子PIF4，也是一個bHLH家族成員，對光敏色素B的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有抑制作用[23]。另外，研究者在西瓜基因組中共計鑒定出96個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，并預(yù)測其中多個bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能在低溫、ABA和鹽脅迫中發(fā)揮重要作用[13]。還有研究者發(fā)現(xiàn)水稻中OsbHLHl基因可能與其抗低溫脅迫相關(guān)[24]。

銀杏是原產(chǎn)中國的特色經(jīng)濟樹種，栽培歷史悠久，用途廣泛，經(jīng)濟價值高，擁有中華樹木“國寶”之稱[25]。植物中的bHLH家族研究在近年來得到了快速發(fā)展，但是到目前為止，在銀杏中被篩選出的bHLH轉(zhuǎn)錄因子并不多，僅有1條被命名為bHLH91的轉(zhuǎn)錄因子被克隆并進行了表達分析[26-27]。本研究通過生物信息學(xué)方法，在全基因組范圍內(nèi)對銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行分離鑒定，并對鑒定出的銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化、啟動子結(jié)構(gòu)和基因表達等方面進行分析，為bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能的解析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 銀杏bHLH家族的篩選

以Pfam數(shù)據(jù)庫中bHLH家族的保守域PF00010為參考序列，用HMMER 3.0軟件在測試銀杏基因組庫（GigaDB，http：//gigadb.org/dataset/100209）中進行檢索。檢索得到的序列用NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線程序進行保守域預(yù)測，去除假陽性序列[28]。將預(yù)測的具有bHLH保守域的序列作為銀杏bHLH家族候選轉(zhuǎn)錄因子，用于后續(xù)分析。

1.2 銀杏bHLH家族的理化性質(zhì)及保守域和保守基序分析

bHLH家族候選蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點等理化性質(zhì)用在線軟件ExPASy中的Prot-Param模塊（https：//web.expasy.org/protparam/）進行分析。用DNAMAN（Lynnon Corporation，USA）對銀杏bHLH家族候選基因編碼的保守氨基酸序列進行多序列比對，并用MEME在線程序（http：//meme-suite.org/tols/meme）進行氨基酸的保守基序分析[29]。

1.3 銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的進化分析

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）中下載擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子序列作為參考，每個亞家族分別下載1～4條，共下載了49條At-bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子[30]。將銀杏候選bHLH蛋白序列與24個AtbHLH參考序列用MUSCLE法進行多序列比對，截取bHLH保守域序列并用軟件MEGA5.0的Neighbo-Joining鄰接法構(gòu)建進化樹，校驗參數(shù)Bootstrap重復(fù)1000次[31]。

1.4 銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)分析

從銀杏基因組數(shù)據(jù)庫中提取篩選出bHLH基因CDS序列對應(yīng)的基因組序列，用GSDS 2.0在線程序繪制基因外顯子-內(nèi)含子模式圖。

1.5 銀杏bHLH家族基因的啟動子分析

從銀杏基因組數(shù)據(jù)庫中截取銀杏bHLH家族基因成員起始密碼子上游2000 bp序列作為啟動子區(qū)，利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫SOGO（https：//sogo.dna.affre.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi？sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace#opennewwindow）分析基因的順式作用元件。

1.6 銀杏bHLH家族基因表達分析

銀杏基因表達數(shù)據(jù)下載于GigaDB，通過Heat-map 2.0作圖，對采集于浙江省天目山的銀杏胚（雌樹）、雄蕊（雄樹）和幼苗（莖和葉混合樣）的bHLH基因表達進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子篩選與理化性質(zhì)分析i

根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫bHLH家族的保守域PF00010特征文件，在銀杏基因組數(shù)據(jù)庫中共檢索到133條可能的bHLH轉(zhuǎn)錄因子序列。候選序列用NCBI-CDD和SMART在線程序?qū)ΡＪ亟Y(jié)構(gòu)域進行檢測，剔除結(jié)構(gòu)域不完整的序列，最后得到72個銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。這些成員在GigaDB數(shù)據(jù)庫中的登錄號見表1。

利用ExPASy在線程序?qū)︺y杏bHLH蛋白質(zhì)的理化特性進行分析。由表1可見，銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員蛋白質(zhì)氨基酸序列含有氨基酸數(shù)目為181～1471，平均值為498;預(yù)測其分子量為2.0220x104～1.6141x105，平均值為5.5240x104;理論等電點在4.75至9.38范圍內(nèi)。從整體看，有64%的銀杏bHLH家族蛋白質(zhì)等電點小于7，等電點在酸性范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子中富含酸性氨基酸。蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果表明，72條序列的疏水性均小于0，說明銀杏bHLH蛋白質(zhì)均為親水蛋白質(zhì)，但是不同蛋白質(zhì)之間親水性存在差異。另外，銀杏bHLH蛋白質(zhì)含有大量脂肪族氨基酸，其中脂肪族氨基酸指數(shù)最大的是Gb_15579。

2.2 銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守域分析

利用DNAMAN9.0對銀杏bHLH家族蛋白質(zhì)保守域進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)銀杏bHLH家族保守域長度多數(shù)在60個氨基酸左右，其中最長的有69個氨基酸，最短的有51個氨基酸（圖1）。在結(jié)構(gòu)域序列保守性方面，除了Loop區(qū)沒有保守位點，其他區(qū)域都有不同數(shù)量的保守位點。在銀杏bHLH蛋白質(zhì)的保守域中共有24個位點上保守氨基酸的出現(xiàn)頻率高于50%，與其他植物類似，其中谷氨酸Glu-12、精氨酸Arg-13、精氨酸Arg-15、精氨酸Arg-16亮氨酸Leu-26、脯氨酸Pro-32、酪氨酸Tyr-65、亮氨酸Leu-69保守性均高于86%，其中精氨酸Arg-15、精氨酸Arg-16保守性為100%。

2.3 銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)生樹分析

根據(jù)預(yù)測到的銀杏bHLH蛋白質(zhì)和隨機選擇的擬南芥bHLH各亞家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似性，利用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。參考擬南芥和水稻的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子的亞家族分類結(jié)果[9]，預(yù)測得到的銀杏72個bHLH轉(zhuǎn)錄因子和隨機選擇的擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分成了21個亞家族，其中第II、Va、VI和第X亞家族只含有擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子。也就是說，銀杏的72個bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分成了17個亞家族（圖2）。在所有含有銀杏bHLH蛋白質(zhì)的17個亞家族中，第Ib亞家族中的銀杏bHLH成員數(shù)量最多，共16個;第IVb、VIlc、IVc、Vb、XI和IX亞家族中的成員數(shù)量相對較少，數(shù)量僅為1～2個。根據(jù)進化樹分類結(jié)果以及各亞家族某些成員在模式植物擬南芥和水稻中的作用，初步判斷銀杏bHLH蛋白質(zhì)的功能。比如la亞家族蛋白質(zhì)可能與細胞分裂和器官分化相關(guān)，Ib亞家族蛋白質(zhì)可能與鐵代謝調(diào)控相關(guān)，Ib亞家族可能在植物的抗低溫脅迫中起重要作用等[32]。銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子在其各種生理過程中的具體功能，還需要進一步研究。

2.4 銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

為了進一步研究銀杏中bHLH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性，通過MEME在線程序?qū)︺y杏72個bHLH蛋白質(zhì)進行保守基序（Motif）分析，識別獲得20個保守基序（圖3）。由圖3可見，屬于同一個亞家族的bHLH基因家族成員有著十分相似的Mo-tif類型和數(shù)量，但同時同一個亞家族成員的Motif模式也存在差異。在所有保守基序中，Motif 1、Motif2和Motif12是bHLH蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的特征保守基序。在所有銀杏bHLH蛋白質(zhì)中，序列Gb_31407的Motif 類型最為簡單，僅有2個成員，最復(fù)雜的是Illd+e亞家族成員，其Motif數(shù)量為9～10個，且該亞家族成員除Gb_31407 沒有Motif13以外，各成員含有的Motif類型完全相同。有一些Motif具有亞家族特異性，比如Motif15、Motif16和Motif18僅在亞家族lb中含有;Motif 17是IVd亞家族特有的保守基序;而Motif8和Motif 11只在亞家族IId+e被發(fā)現(xiàn);XII亞家族中特有的Motif有4個，分別是Motif 7、Motif 9、Motif 19和Motif 20。

2.5 銀杏bHLH家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析

運用GSDS 2.0軟件繪制銀杏基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖并對其結(jié)構(gòu)進行分析和整理。由圖4可知，銀杏bHLH基因家族分為內(nèi)含子富集和內(nèi)含子缺失2類，其中Gb_06182、Gb_11960、Gb_12264、Gb_17737、Gb_27302、Gb_27869、Gb_28786、Gb_36294無內(nèi)含子，Gb_39491、Gb_37668、Gb_37667、Gb_31785、Gb_20754、Gb_12744、Gb_10001、Gb_05276僅1個內(nèi)含子，以上成員均屬于內(nèi)含子缺失組;Gb_30839含9個內(nèi)含子（占比1%），Gb_15442、Gb_39758含8個內(nèi)含子（占比3%），Gb_40829、Gb_36369、Gb_33185、Gb_32265、Gb_30387、Gb_29750、Gb_24992、Gb_13867、Gb_13550、Gb_12493、Gb_07223含7個內(nèi)含子（占比15%），Gb_65320、Gb_07156、Gb_20300、Gb_21415、Gb_22201含6個內(nèi)含子（占比7%），Gb_37017、Gb_28850含5個內(nèi)含子（占比3%），以上成員均屬內(nèi)含子富集組。其中含有2個內(nèi)含子的bHLH基因17個，所占成員總數(shù)比例最多，達24%。此外，基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，銀杏bHLH基因家族各成員基因長度具有明顯的差異。其中最短的Gb_05276 只有859 bp;而Gb_01625序列最長，達到了257612 bp。

2.6 銀杏bHLH家族基因啟動子分析

銀杏bHLH基因啟動子序列分析結(jié)果（表2）顯示，72個bHLH基因的啟動子調(diào)控區(qū)域均含有與光調(diào)控、脫落酸、葉肉特異性表達、花粉特異性表達、莖特異性表達有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子作用元件，例如GT1CONSENSUS、EBOX BNNAPA、CACTFTPPCA1、POLLEN1LELAT52和NODCON2GM。統(tǒng)計結(jié)果表明，有63%和79%的銀杏bHLH基因成員含有植物生長激素響應(yīng)元件（ARFAT和NTBBF1ARROLB），65%的bHLH基因含脫落酸響應(yīng)元件（ABRELAT-ERD1），71%和68%的bHLH基因含有赤霉素響應(yīng)元件（GAREAT和CAREOSREP1），57%的bHLH基因含有乙烯響應(yīng)元件（ERELEE4），92%的bHLH基因含有與根瘤菌有關(guān)的特異性保守序列響應(yīng)元件（NODCON1GM），96%的bHLH基因含有脅迫響應(yīng)元件（CCAATBOX1），99%的bHLH基因含有疾病防御響應(yīng)元件（BIHD1OS），97%的bHLH基因含有糖響應(yīng)元件（WBOXHVISO1），57%的bHLH基因含有種子特異性表達元件（SEF1MOTIF）。說明各bHLH基因的表達與銀杏抗逆境以及生長發(fā)育有重要聯(lián)系。

2.7 銀杏bHLH家族基因表達分析

從銀杏基因組數(shù)據(jù)庫中下載基因表達數(shù)據(jù)，將其中bHLH基因的表達數(shù)據(jù)用heatmap2.0作圖（圖5）。由圖5可知，在銀杏所有bHLH家族基因中有8個在胚、雄蕊和幼苗3個器官中都沒有檢測到表達，另外有7個基因的表達具有組織特異性。由圖5可以看出，在胚中表達水平較高的有Gb_20471（36.86）、Gb_41424（81.93）和Gb_15579（40.27），另外Gb_05307、Gb_28786和Gb_01625表達量（RP_KM值）也達到10以上;雄蕊中表達量超過10的基因有19個，需要特別指出的是Gb_41424和Gb_15579基因的表達量分別高達79.48和297.03，而且Gb_15579在3個樣品中表達量都比較高，在雄蕊中表達量是所有測試基因中表達最高的;在銀杏幼苗中表達量超過10的基因有17個，其中Gb_20471、Gb_41424、Gb_21105和Gb_15579的表達量分別高達36.61、57.86、64.26和70.70?？傮w來看Gb_20471、Gb_41424、Gb_28786和Gb_15579在3個樣品中表達水平都比較高。其中Gb_28786和Gb_15579分別屬于ld+e和Ia+c亞家族，可能參與銀杏中茉莉酸代謝的調(diào)控;Gb_20471和Gb_41424屬于IVe亞家族，可能參與植物金屬穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。

3 討論

本研究通過對銀杏全基因組進行搜索，最終篩選出了72個bHLH基因，并且對它們的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化和基因表達等情況進行了詳細的分析。銀杏bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守區(qū)域中有His、Glu、Arg和Leu等高度保守的氨基酸殘基[33]。通過系統(tǒng)發(fā)育分析可將銀杏和擬南芥的bHLH成員分為21個亞家族11.34-35]。本研究對篩選的銀杏bHLH的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)有些基因在胚（雌樹）、雄蕊（雄樹）和幼苗（莖和葉混合樣）3種樣品中都未被檢測到表達，可能這些基因在特定時間或某種脅迫條件下才會表達。還有些基因的表達具有組織特異性，也有幾個基因在3種樣品中的表達水平都比較高，說明有些bHLH基因在某些特定組織中才會發(fā)揮作用，也有些基因在所有組織中都發(fā)揮作用。

近年來，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝調(diào)控，中的作用受到許多研究者的關(guān)注，相關(guān)研究取得很大進展。Gonzalez等[36]和Xie等[3]發(fā)現(xiàn)了多個bHLH轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥花青苷代謝相關(guān)。Dom-brecht等[38]和Schweizer等[39還發(fā)現(xiàn)多個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在黃酮代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用。此外，bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子還在吡啶類生物堿代謝、糖苷生物堿代謝、紫杉烷類代謝、異喹啉類生物堿代謝和萜類代謝等多種植物代謝途徑中被發(fā)現(xiàn)[4041]。黃酮和萜類是銀杏中主要的藥用成分，其代謝通路中多數(shù)關(guān)鍵基因已經(jīng)被研究，但是其轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究還在摸索階段。bHLH轉(zhuǎn)錄因子在銀杏黃酮和萜類代謝中的調(diào)控作用是將來研究的一個重要方面。

總之，轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的基因調(diào)控蛋白質(zhì)，生物體的一系列生理生化活動都離不開轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，它不僅可以調(diào)節(jié)生物體的新陳代謝和生長發(fā)育，而且在響應(yīng)外界脅迫方面也起著重要的作用[42]。本研究利用生物信息學(xué)方法，對銀杏bHLH基因家族進行了系統(tǒng)深入的分析，為未來的基因克隆提供了豐富的資源，可為將來深入研究該家族基因的表達調(diào)控、結(jié)構(gòu)和功能等提供參考。

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