趙為民　方曉敏　涂楓　周李生　李碧俠　王學(xué)敏　付言峰　任守文

摘要：lncRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有重要功能的RNA分子，在各種生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。為鑒定豬單核源性巨噬細(xì)胞受FSL-1刺激后相關(guān)的lneRNA，利用二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)lncRNA進(jìn)行了組裝與特征分析。結(jié)果顯示FSL-1刺激成功地構(gòu)建了細(xì)胞炎癥模型，試驗(yàn)組與對(duì)照組共鑒定到l056個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本，其對(duì)應(yīng)于831個(gè)基因座，這些lneRNA的平均長(zhǎng)度為1643 bp，平均外顯子數(shù)為2.4個(gè)。相對(duì)于對(duì)照組，試驗(yàn)組有51個(gè)IncRNA.上調(diào)表達(dá)，44個(gè)lncRNA下調(diào)表達(dá)。在上調(diào)lncRNA兩側(cè)相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、病毒反應(yīng)等通路，而在下調(diào)lncRNA兩側(cè)相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因參與的通路較少，不參與上述通路。定量PCR結(jié)果顯示挑選的4個(gè)lncRNA的差異倍數(shù)與RNA-Seq的結(jié)果相似，其中上調(diào)的IncRNA呈現(xiàn)一定的組織特異表達(dá)，而下調(diào)的lncRNA呈現(xiàn)多組織表達(dá)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究IncRNA在FSL-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬;IneRNA;單核源性巨噬細(xì)胞;FSL-1;炎癥

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-4440（2019）02-0346-11

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，ln-cRNA）是一類不具有編碼蛋白質(zhì)能力而本身長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的RNA分子?；谄湓诨蚪M上相對(duì)于蛋白質(zhì)編碼基因的位置主要可分為3種：基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long intervening non-coding RNA，lineRNA），自然反義鏈（Natural antisense transcript，NAT）和內(nèi)含子長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Intronic long non-coding RNA）。lncRNA 由于其較低的物種間保守性在最初大量發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪音，不具有生物學(xué)功能"。隨著近年對(duì)lncRNA研究的不斷深入，lncRNA受到越來(lái)越多的關(guān)注，其功能從最初參與的X染色失活[2]到后來(lái)的細(xì)胞亞小體生成[3]、細(xì)胞重編程[4]胚胎發(fā)育[5]、干細(xì)胞多能性[6]、肌與脂肪生成[7-8]、腫瘤癌癥[9-10]等各種細(xì)胞生命活動(dòng)中。

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵御病原體入侵的第一道防線，其介導(dǎo)宿主的早期炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體在抵抗病原體感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用”。然而炎癥反應(yīng)中炎癥因子的紊亂表達(dá)會(huì)影響宿主對(duì)病原體感染的抵抗，研究結(jié)果表明，肺部炎癥因子的紊亂表達(dá)與宿主對(duì)支原體肺炎的易感性密切相關(guān)[12-13]。炎癥因子的釋放由宿主PRRs與PAMP的識(shí)別以及細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列事件構(gòu)成[11]，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明炎癥因子的釋放不僅受到一些經(jīng)典的相關(guān)蛋白質(zhì)基因和miRNA調(diào)控[11，14]，IncRNA在其中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[15-16]，因而探索lncRNA在炎癥反應(yīng)中的作用對(duì)深入了解炎癥因子的精確調(diào)控具有重要意義。

巨噬細(xì)胞作為宿主與外界病原體之間天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵防線，其與病原體之間的互作情況對(duì)宿主的感染進(jìn)程有重要的決定作用[17-20]。來(lái)源于外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PM-BC）在體外培養(yǎng)時(shí)通過(guò)添加粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）可形成單核源性巨噬細(xì)胞（Monocyte-derived macrophage，MDM）[21]。相對(duì)于屠宰豬獲取的巨噬細(xì)胞，MDM的獲取簡(jiǎn)單方便，因而可對(duì)不同品種、不同年齡階段豬種進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的研究。

本研究通過(guò)RNA-Seq結(jié)合生物信息學(xué)分析對(duì)豬單核源性巨噬細(xì)胞受支原體脂蛋白FSL-1刺激后的IneRNA進(jìn)行鑒定與特征分析，為進(jìn)一步研究IncRNA在FSL-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

RNA提取試劑盒Direct-zolTM RNA Kits 購(gòu)于Zymo research 公司，DNA marker、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM II定量試劑盒購(gòu)于TaKa-Ra公司，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清購(gòu)于Thermofisher公司，豬外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液KIT購(gòu)于天津TBD公司，GM-CSF購(gòu)于RD system公司，F(xiàn)SL-1購(gòu)于InvivoGen公司。

1.2 豬單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及FSL-1刺激

豬來(lái)源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地，蘇山豬種，采用豬外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液KIT分離3頭健康豬外周血單核細(xì)胞，全培養(yǎng)基（10%FBS+90%RPMI1640）中添加終質(zhì)量濃度20ng/mlGM-CSF培養(yǎng)7d，每2.5d換1次液，得到豬單核源性巨噬細(xì)胞121-22，設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度100ng/ml的FSL-1，對(duì)照組加入相應(yīng)的PBS，刺激6h后收集細(xì)胞提取RNA。

1.3 RNA測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建

RNA提取參照試劑盒說(shuō)明書操作，并進(jìn)行DNaseI處理，純化及回收。DNaseI處理效果用PCR檢測(cè)，引物見(jiàn)表1，Agilent 2100分析RNA的完整性，當(dāng)RNA完整性相關(guān)參數(shù)RIN≥8，28S/l8S≥1.5時(shí)可進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。RNA測(cè)序文庫(kù)依據(jù)NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for llumina的說(shuō)明操作，簡(jiǎn)單如下：提取總RNA先進(jìn)行poly+A的純化，然后進(jìn)行eDNA第一鏈及第二鏈的合成，再對(duì)cDNA產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，3'末端加A和加A-dapter，最后進(jìn)行連接產(chǎn)物的純化回收，上樣測(cè)序，產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)Raw reads。

1.4 轉(zhuǎn)錄本的構(gòu)建及l(fā)ncRNA的鑒定流程

Rawreads經(jīng)過(guò)去除Adapter、ploy-N以及低質(zhì)量的Reads，得到Clean reads。然后通過(guò)HISAT2將Clean reads比對(duì)豬基因組Sserofa11.1，基于比對(duì)結(jié)果用StringTie組裝轉(zhuǎn)錄本，從NCBI和Ensemble上分別下載豬的蛋白質(zhì)編碼基因的位置信息（染色體及其起始終止位置），版本分別為NCBI AnnotationRelease：106（豬的蛋白質(zhì)編碼基因以NM_和XM_開頭）和Ensemble release 91（Protein_coding）。采用以下步驟來(lái)鑒定lncRNA：（1）過(guò)濾小于200bp長(zhǎng)度以及表達(dá)量極低的轉(zhuǎn)錄本（FPKM<0.01）;（2）去除和NCBI以及Ensemble中豬蛋白質(zhì)編碼基因位置重疊的轉(zhuǎn)錄本;（3）去除Coding potential calculator（CPC）（231 tool>0的轉(zhuǎn)錄本;（4）去除NCBI blastX中有對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProtKB/Swiss-Prot（swis-sprot）的轉(zhuǎn)錄本（E-value<10-'）;（5）將剩余的轉(zhuǎn)錄本翻譯成相應(yīng)氨基酸序列，使用隱馬爾可夫模型（Hidden markov models，HMMs）對(duì)Pfam蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除在Pfam中有對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本;最終剩余的轉(zhuǎn)錄本為lncRNA。

1.5 差異IncRNA的保守性與重復(fù)序列分析

用HTseq對(duì)組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)水平的定量分析，然后使用DEseq2對(duì)組間的lncRNA進(jìn)行表達(dá)差異分析。將變化倍數(shù)（Fold change）≥2以及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05作為差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)下載入和小鼠的IncRNA序列，利用BLASTN比對(duì)程序，分析差異lncRNA與人和小鼠lncRNA之間的保守性。利用RepeatMasker網(wǎng)站對(duì)差異lncRNA序列中可能存在的重復(fù)序列元件類別進(jìn)行在線分析。在Search engine中選擇Cross_match，在DNA source中選擇物種Pig，其它選擇參數(shù)為默認(rèn)。

1.6 差異IncRNA兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因的GO與KEGG分析

以上述NCBI Annotation Release：106和Ensemble Release 92的蛋白質(zhì)編碼基因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)，選擇差異lncRNA兩側(cè)相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因，使用DA-VID（Database for annotation，visualization and integrated discovery）對(duì)這些蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行GO（Gene ontology）和KEGG pathway（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析，研究這些蛋白質(zhì)編碼基因參與的生物學(xué)功能與途徑。篩選條件選擇Count=2，EASE=0.05，F(xiàn)old enrichment≥1.5。

1.7 差異IncRNA定量PCR驗(yàn)證

對(duì)照組與試驗(yàn)組RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別挑選2個(gè)上調(diào)和下調(diào)的lncRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，以HPRT作為內(nèi)參基因，在ABI 7500儀器上進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，對(duì)照組與試驗(yàn)組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)3次。熒光定量PCR按照試劑盒說(shuō)明書操作，定量數(shù)據(jù)用2-00“法處理，差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量及其測(cè)序文庫(kù)數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過(guò)Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)6個(gè)樣本RNA的RIN為9.0～9.4，28S/18S為2.1～2.5，符合RNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建要求。通過(guò)在IL1B外顯子_上設(shè)計(jì)不夸內(nèi)含子的擴(kuò)增引物來(lái)確認(rèn)RNA中是否有DNA污染。我們對(duì)RNA DNase I處理前后的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，直接以DNase I處理前后的RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以豬基因組和Pegfp-N1作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照。圖1A和圖1B顯示在DNase I處理前，對(duì)照組與試驗(yàn)組的RNA里均能擴(kuò)增出IL1B產(chǎn)物，DNaseI處理后均擴(kuò)增不出IL1B產(chǎn)物，說(shuō)明DNase I處理能消除RNA樣品中的DNA。RNA測(cè)序方面，6個(gè)樣本中經(jīng)過(guò)RNA-Seq產(chǎn)出的Cleandata在6.52～7.35Gb，GC含量都在53%左右，其Q20百分比都在95%以上，Q30百分比都在90%以_上。

2.2 差異蛋白質(zhì)編碼基因參與的生物學(xué)過(guò)程

對(duì)豬的蛋白質(zhì)編碼基因分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，試驗(yàn)組有1295個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因呈現(xiàn)變化倍數(shù)。對(duì)這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行GO的生物學(xué)過(guò)程分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因一共參與327個(gè)生物學(xué)進(jìn)程，其中最顯著富集的第1到第10個(gè)進(jìn)程依次排序?yàn)镚O：0006954（炎癥反應(yīng)）、GO：0006955（免疫反應(yīng)）、GO：0032496（脂多糖反應(yīng)）、GO：0071222（細(xì)胞對(duì)脂多糖反應(yīng)）、GO：0050729（炎癥反應(yīng)的正調(diào)節(jié)）、GO：0030335（細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)）、GO：0006915（凋亡過(guò)程）、GO：0009615（病毒反應(yīng)）GO：0050731（肽酪氨酸磷酸化的正調(diào)節(jié)）與GO：0051607（病毒防疫反應(yīng)）。這些進(jìn)程涉及到炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、病毒響應(yīng)、肽酪氨酸磷酸化等，而在這前10個(gè)進(jìn)程中有7個(gè)涉及到免疫、炎癥及抗病毒反應(yīng)（圖2）。

2.3 lncRNA的鑒定與結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過(guò)HISAT2比對(duì)和StringTie組裝后的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過(guò)層層過(guò)濾后最終得到1056個(gè)lIncRNA轉(zhuǎn)錄本，其對(duì)應(yīng)于831個(gè)基因座，這些IncRNA的平均長(zhǎng)度為1643bp，平均外顯子數(shù)為2.4個(gè)。對(duì)lncRNA的長(zhǎng)度區(qū)間進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)（圖3），在200～500bp與501～1000bp的IncRNA占總數(shù)的52%，隨著長(zhǎng)度的不斷增加，lncRNA所占的比例逐漸減小。而對(duì)于外顯子分布的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，只有1個(gè)和2個(gè)外顯子的lncRNA占總數(shù)的64%，隨著外顯子數(shù)目的不斷增加，lncRNA所占的比例也逐漸減小。lIn-cRNA在不同的染色體，上都有不同程度的分布，在Y染色體上的數(shù)量最少。

2.4 差異表達(dá)IncRNA的鑒定

通過(guò)分析與比較，在對(duì)照組與試驗(yàn)組之間共有95個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，相對(duì)于對(duì)照組，試驗(yàn)組有51個(gè)lncRNA，上調(diào)表達(dá)（表2），44個(gè)lncRNA下調(diào)表達(dá)（表3）。

2.5 差異表達(dá)IncRNA的保守性分析

Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中人有7856個(gè)lncRNA基因，小鼠有5438個(gè)lncRNA基因。進(jìn)行BLASTN比對(duì)后，在95個(gè)差異的豬lncRNA中有10個(gè)IncRNA與人lncRNA同源;而只有1個(gè)lncRNA與小鼠ln-cRNA同源（E-value<10-5），分別占到了其總數(shù)的10.50%和1.05%，同時(shí)與人和小鼠IncRNA同源的有1個(gè)lncRNA。在與小鼠lncRNA同源的豬ln-cRNA中，其同源序列長(zhǎng)度跨度為327～620bp，平均長(zhǎng)度為514bp;在與人lncRNA同源的豬lncRNA中，其同源序列長(zhǎng)度跨度為31～1301bp，平均長(zhǎng)度為490bp。

2.6 差異表達(dá)IncRNA的重復(fù)序列分析

通過(guò)RepeatMasker分析發(fā)現(xiàn)，95個(gè)差異ln-cRNA中有81個(gè)lneRNA序列中含有重復(fù)元件，占到了總數(shù)量的85%。對(duì)lncRNA序列中重復(fù)元件的種類分析發(fā)現(xiàn)，短散在重復(fù)序列（SINE）和長(zhǎng)散在重復(fù)序列（LINE）分別占到了重復(fù)元件總數(shù)的40.4%和17.7%，長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）占到了11.6%，簡(jiǎn)單重復(fù)占16.9%，這幾種常見(jiàn)的重復(fù)元件占到了總重復(fù)元件類型的86.6%，剩余的是一些不常見(jiàn)的類型。進(jìn)一步對(duì)不同含量區(qū)間的lncRNA分析發(fā)現(xiàn)，以10%為1個(gè)區(qū)間，在含0～10.0%，10.1%～20.0%，20.1%～30.0%，30.1%～40.0%重復(fù)元件的lncRNA占總數(shù)的10%以上，含50%以上重復(fù)元件的lncRNA數(shù)量較少（圖4）。

2.7 差異表達(dá)lncRNA兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因的GO與KEGG分析

通過(guò)對(duì)95個(gè)差異表達(dá)的IncRNA與豬NCBI和Ensemble蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)染色體位置比較，163個(gè)有官方名稱的蛋白質(zhì)編碼基因處于差異IncaNa兩側(cè)。我們對(duì)這163個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行GO與KEGG分析。在GO分析中，這些蛋白質(zhì)編碼基因共參與了22類生物學(xué)進(jìn)程（圖5）。這22類進(jìn)程中涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病毒反應(yīng)、器官形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖、體液免疫等，其中6個(gè)進(jìn)程與病毒反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)，分別為GO：0009615（病毒反應(yīng)）、GO：0006959（體液免疫反應(yīng)）、GO：0051607（病毒防疫反應(yīng)）、GO：0060337（I型干擾素信號(hào)通路）、GO：0070098（趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路）、GO：0002548（單核細(xì)胞趨化性）。

對(duì)51個(gè)上調(diào)表達(dá)的IncANA兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)編碼基因一共參與了26類生物學(xué)進(jìn)程（圖6）。這26類進(jìn)程中涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞增殖、G蛋白受體信號(hào)、器官形態(tài)發(fā)生等，其中有11個(gè)進(jìn)程涉及到病毒反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥因子，分別為GO：007008（趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路）、GO：0006955immune response（免疫反應(yīng)）、GO：000615（病毒反應(yīng)）、CO0002548（單核細(xì)胞趨化性）、GO：000935（趨化性）GO：000959（體液免疫反應(yīng)）、GO：000954（炎癥反應(yīng)）、GO：006037（I型干擾素信號(hào)通路）、GO：0030593（中性粒細(xì)胞趨化性）、GO：0051607（病毒防疫反應(yīng)）、GO：0071347（細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素1的反應(yīng)）。對(duì)44個(gè)下調(diào)表達(dá)的IncaNa兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)編碼基因共參與了3類生物學(xué)過(guò)程（圖7）。這3個(gè)過(guò)程涉及到DNA重組、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控、心內(nèi)膜墊層形成等。

對(duì)差異表達(dá)的IncANa兩側(cè)的163個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行KEGG

pathway分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)編碼基因總共參與了6個(gè)Pathway，這些Pathway涉及到細(xì)胞因子受體結(jié)合、A型流感、Rapl信號(hào)通路美洲錐蟲病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移與趨化因子信號(hào)通路（圖8），其中絕大部分與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)相關(guān)。對(duì)51個(gè)上調(diào)表達(dá)的IncaNa兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行KEGG

pathway分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)編碼基因總共參與了7個(gè)Pathway，這些Pathway涉及到細(xì)胞因子受體結(jié)合、A型流感、Rapl信號(hào)通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、美洲錐蟲病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移與趨化因子信號(hào)通路（圖9），其中絕大部分也與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)相關(guān)。然而對(duì)44個(gè)下調(diào)表達(dá)的Incana兩側(cè)的75個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行KEGG pathway分析時(shí)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有Pathway被顯著富集。

2.8 差異表達(dá)IncaNa定量PCR驗(yàn)證

我們?cè)谏险{(diào)和下調(diào)的IncANa中分別選取2個(gè)Incana進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。在上調(diào)的2個(gè)lncRNA中，Incana-MSTRG.8350的兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因?yàn)镃XCL8與CXCL6，通過(guò)上述的GO與KEGG注釋顯示它們與免疫反應(yīng)、趨化因子通路相關(guān);lncRNA-MSTRG.8244其兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因RHOH與CHRM9分別與信號(hào)傳導(dǎo)和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移相關(guān)，與炎癥反應(yīng)間接相關(guān)。下調(diào)中的Incana兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因在GO與KEGG注釋中均沒(méi)有涉及到免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、趨化因子、病毒響應(yīng)，故隨機(jī)選取了2個(gè)IncaNa，分別為Incana-MSTRG.3552與Incana-MSTRG.12242。定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比Incana-MSTRG.8350和IncanaMSTRG.8244顯著上調(diào)（P<0.01），IncRNA-MstrG12242和Incana-MSTRG3552顯著下調(diào)（P<0.01）（圖10），上調(diào)和下調(diào)差異倍數(shù)與RNA-seq的差異倍數(shù)相似，表4為qPCR差異倍數(shù)與RNA-Seq差異倍數(shù)比較。

2.9 IncANa組織表達(dá)譜

以成年豬的心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、背肌等組織的cDNA為模板，對(duì)上述上調(diào)和下調(diào)的4個(gè)Incana進(jìn)行組織表達(dá)譜分析。結(jié)果（圖11）顯示在上調(diào)的2個(gè)Incana中，Incana-MSTRG8350僅在肺中有微弱的表達(dá)，不表達(dá)于其他組織，Incana-MSTRG.8244在脾中表達(dá)相對(duì)較高，在肝小腸中表達(dá)較弱。在下調(diào)的2個(gè)IncaNa中，IncaNa-MSTRG.12242與IncaNa-MSTRG.3552均呈現(xiàn)多組織表達(dá)

3 討論

IncaNa可通過(guò)本身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)之間互作，從而在多種層面上調(diào)控炎癥因子的表達(dá)水平6.2。從Incana這一新的調(diào)控分子去研究炎癥因子的表達(dá)調(diào)控能更加全面地理解炎癥反應(yīng)的機(jī)理。基于此，本研究通過(guò)RNA-Seq測(cè)序并結(jié)合生物信息學(xué)分析對(duì)豬單核源性巨噬細(xì)胞受支原體脂蛋白FSL-1刺激后的Incana進(jìn)行了鑒定與特征分析。

支原體細(xì)胞膜上的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白是其介導(dǎo)宿主發(fā)生天然免疫的重要抗原3，由于絕大部分支原體的脂蛋白結(jié)構(gòu)是雙酰基而不是三?；?），因而我們?cè)谥鞍咨线x取了雙?；Y(jié)構(gòu)的FSL-1脂蛋白，這更好地模擬支原體脂蛋白對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)在脂蛋白FSL-1刺激細(xì)胞后，其差異基因參與的最顯著的通路都集中在炎癥與免疫反應(yīng)上，這說(shuō)明FSL-1刺激成功地構(gòu)建了細(xì)胞炎癥模型。我們?cè)贗ncana的鑒定中由于Incana基因與蛋白質(zhì)編碼基因的起始位置不重疊，實(shí)際上得到是lincrna。lincrna由于不與其他蛋白質(zhì)編碼基因重疊而具有相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，這也便于對(duì)其表達(dá)和調(diào)控進(jìn)行更好的研究。Incana基因一般長(zhǎng)度在1kb左右，外顯子數(shù)目大多數(shù)為1～327。本研究結(jié)果顯示Incana平均長(zhǎng)度為1643bp，平均外顯子數(shù)為2.4個(gè)，而且長(zhǎng)度在1000bp以下和外顯子數(shù)在2以下的Incana都占到了總數(shù)的50%以上，表現(xiàn)出較短的長(zhǎng)度以及較少的外顯子數(shù)，這也與報(bào)道相符合，表明我們得到的Incana是可信賴的。IncaNA基因由于部分和經(jīng)典的蛋白質(zhì)編碼基因mRNA結(jié)構(gòu)相似，也顯示出一定的轉(zhuǎn)錄剪接28，我們鑒定的1056個(gè)IncanA轉(zhuǎn)錄本，其對(duì)應(yīng)于831個(gè)基因座，這也說(shuō)明其中有些IncaNa基因發(fā)生了選擇性剪接，產(chǎn)生了2個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄本。我們發(fā)現(xiàn)在差異lncRNA基因中，分別有10.50%和1.05%的Incana與人和小鼠同源，這表明相對(duì)于小鼠，豬的Incana與人的更為保守。研究結(jié)果表明基因組的重復(fù)序列可能是Incana產(chǎn)生的主要來(lái)源。我們對(duì)差異IncaNa的序列分析發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的差異Incana中都含有重復(fù)序列，這也與上述結(jié)論相符。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)短散在重復(fù)序列（SINE）占到了差異lncRNA中總重復(fù)序列種類的40%，這說(shuō)明差異lncRNA可能大部分來(lái)源于基因間的短散在重復(fù)序列區(qū)間。

Incana通過(guò)順式作用0與反式作用來(lái)發(fā)揮其重要功能，雖然目前還未有較好的方法來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)Incana的功能，然而通常可根據(jù)Incana的這些調(diào)控方式來(lái)預(yù)測(cè)其功能，一般對(duì)Incana兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因參與的通路來(lái)預(yù)測(cè)Incana可能的功能。在本研究中，我們對(duì)差異IncaNa兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行GO與KEGG分析發(fā)現(xiàn)，在GO分類中，差異IncaNa包括上調(diào)與下調(diào)Incana兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因參與了22個(gè)生物學(xué)過(guò)程，其中6個(gè)與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)直接相關(guān)，而對(duì)上調(diào)的lncRNA兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因分析發(fā)現(xiàn)，它們參與26個(gè)生物學(xué)過(guò)程，其中11個(gè)與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)直接相關(guān)，占到了大約一半的比例;而對(duì)下調(diào)的lncRNA兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因分析發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的通路。這說(shuō)明上調(diào)的IncaNa更傾向于富集在與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因兩側(cè)，可能具有重要作用。KEG的通路分析結(jié)果也與GO分析結(jié)果相符合，上調(diào)的Incana兩側(cè)蛋白質(zhì)編碼基因幾乎都參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路，而下調(diào)的Incana兩側(cè)的蛋白質(zhì)編碼基因沒(méi)有參與生物學(xué)進(jìn)程。我們進(jìn)一步對(duì)上調(diào)和下調(diào)的Incana進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，結(jié)果表明位于與炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因兩側(cè)的2個(gè)上調(diào)In-cRNA，都呈現(xiàn)出一定的組織特異表達(dá)，其中一個(gè)表現(xiàn)出嚴(yán)格的組織表達(dá)，而在下調(diào)的IncaNa中與此相比都表現(xiàn)出多組織表達(dá)。研究結(jié)果表明，嚴(yán)格的組織表達(dá)或時(shí)序特異性表達(dá)的Incana具有重要功能（30321，這也在一定程度上說(shuō)明了上調(diào)的IncANa尤其是位于與炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因兩側(cè)的IncaNa值得進(jìn)一步深入研究。

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