姚啟倫　李玉潔　陳發(fā)波　高健　李文博　方平　李紅艷

摘要：探討優(yōu)化玉米染色體滴片關(guān)鍵因子處理效果，尋求一種操作簡單、染色體分散度和完整性好，并且適于玉米染色體分離操作的制片方法。本研究以玉米自交系B73根尖為材料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用四因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)，分析玉米滴片技術(shù)中4個(gè)關(guān)鍵因子的處理效果。結(jié)果表明，NO處理時(shí)間、冰乙酸固定時(shí)間、酶解時(shí)間和滴片距離對(duì)染色體滴片效果均存在最佳處理效應(yīng)?；诙位貧w方程的統(tǒng)計(jì)方法得到了符合實(shí)際的優(yōu)化的染色體滴片技術(shù)方案，即采用NO處理時(shí)間2.0h、冰乙酸固定時(shí)間2.0h、酶解時(shí)間6.0h和滴片距離35.0cm。由此方案制作了高質(zhì)量的玉米染色體制片，保證了細(xì)胞中染色體的分散性和完整性。

關(guān)鍵詞：玉米;染色體;滴片;優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S513

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-4440（2019）02-0255-07

染色體作為基因的載體，一直是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。染色體制片是觀察、鑒定染色體的基本方法，它是進(jìn)行生物染色體組型分析、染色體顯帶、染色體畸變分析、染色體特殊成分鑒定、DNA原位雜交和單染色體分離研究的重要技術(shù)手段。傳統(tǒng)的染色體制片技術(shù)是壓片法和火焰干燥法，眾多學(xué)者就染色體制片過程中的取材時(shí)間、預(yù)處理方式、冰乙酸固定時(shí)間、細(xì)胞解離及染色方法等作了大量卓有成效的研究。潘頎等以新疆紫草為材料，用壓片法研究染色體制片技術(shù)，其研究結(jié)果表明，新疆紫草染色體制片效果主要取決于秋水仙素預(yù)處理時(shí)間、處理溫度和細(xì)胞解離時(shí)間3個(gè)關(guān)鍵處理因子。勞世輝等采用火焰干燥法制備菠蘿蜜染色體制片，通過比較不同預(yù)處理試劑和預(yù)處理時(shí)間的作用效果，發(fā)現(xiàn)以1：1（體積比）的8-羥基喹啉（0.002mol/L）與秋水仙素（0.2%）混合液預(yù)處理制片材料，可達(dá)到理想的染色體制片效果。陳雪等通過對(duì)射干染色體壓片技術(shù)研究指出，室溫下用秋水仙素（0.1%）預(yù)處理材料8h和379C下酶解材料60min，用壓片法可制作出染色體分散良好的制片。劉丹等通過比較分析多種植物的染色體壓片技術(shù)，認(rèn)為壓片法中制約植物染色體制片效果的關(guān)鍵處理因子是預(yù)處理藥劑和時(shí)間。分子生物技術(shù)的發(fā)展對(duì)染色體制片技術(shù)提出新的更高的要求，一張高質(zhì)量的染色體制片要求處于有絲分裂中期相的細(xì)胞多，染色體交叉重疊少、分散性好，細(xì)胞內(nèi)容物少、清晰度高。染色體滴片法是新興的一種染色體制片方法，目前國內(nèi)鮮見有關(guān)染色體滴片技術(shù)研究的相關(guān)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以遺傳學(xué)研究的模式生物一玉米為染色體制片材料，采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)法分析影響染色體滴片效果的4個(gè)關(guān)鍵因子，為規(guī)范玉米染色體滴片技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用典型玉米自交系B73作染色體制片材料，玉米自交系B73種子由長江師范學(xué)院玉米育種課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體滴片制作

1.2.1.1 胚根在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪一層無菌紗布，放入預(yù)浸6h的玉米種子，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25C培養(yǎng)1～2d，待胚根長1.0～2.0cm時(shí)，剪取1.0～1.5cm根尖置入盛有超純水的EP管中，讓濕潤根尖貼于管壁。1.2.1.2 NO處理將裝有根尖的EP管放入NO處理罐，在0.5Pa的壓強(qiáng)下進(jìn)行NO處理，NO處理罐由解壓閥、NO罐、連接管、處理罐和三通閥組成。

1.2.1.3 冰乙酸固定取出EP管并滴加適量90%冰乙酸對(duì)根尖材料進(jìn)行固定處理。

1.2.1.4 材料漂洗固定后的根尖材料從EP管取出，在盛有超純水的培養(yǎng)皿中漂洗2～3次，然后置于載玻片切取根尖分生區(qū)。

1.2.1.5 制備細(xì)胞懸液根尖分生區(qū)材料在37C溫度下酶解，酶解后的材料用70%乙醇清洗2次，再置入瞬時(shí)離心機(jī)離心2次，每次8s，最后加入冰乙酸，搗碎混勻制成細(xì)胞懸液。

1.2.1.6 細(xì)胞懸液滴片用移液槍吸10μl細(xì)胞懸液，在一定高度依靠其自身重力直接滴加在載玻片上，待滴液干燥后進(jìn)行染色處理。

1.2.1.7 鏡檢在光學(xué)顯微鏡下觀察、鑒定滴片中細(xì)胞有絲分裂中期染色體，并利用照像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

1.2.2 制訂染色體制片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)以染色體滴片效果為考察指標(biāo)，根據(jù)有絲分裂中期相的細(xì)胞數(shù)、染色體重疊率、單細(xì)胞染色體數(shù)和細(xì)胞內(nèi)溶物面積比4個(gè)參數(shù)值，對(duì)染色體滴片效果進(jìn)行評(píng)定等級(jí)，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)基于前期大量的玉米染色體滴片試驗(yàn)，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照賈建的方法，按不同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇不同的NO處理時(shí)間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、冰乙酸固定時(shí)間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、酶解時(shí)間（5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h）和滴片距離（10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0cm）。用二次回歸正交組合設(shè)計(jì)分析染色體滴片效果與各關(guān)鍵因子間的線性關(guān)系。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)處理作為二次回歸正交設(shè)計(jì)的零水平，進(jìn)行回歸正交試驗(yàn)，建立染色體滴片效果與各關(guān)鍵因子的回歸方程，以探究玉米染色體滴片法的最佳技術(shù)方案。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，利用DPS軟件進(jìn)行二次回歸正交組合設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析，建立回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 各關(guān)鍵因子對(duì)染色體滴片的處理效果

由表2可知，NO處理時(shí)間分別為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h時(shí)，玉米染色體滴片效果的得分等級(jí)分別為1、2、5、4和3，以2.0hNO處理時(shí)間的評(píng)分等級(jí)最高，染色體滴片效果最好（圖1a3）。冰乙酸固定根尖材料時(shí)間分別為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h時(shí)，其滴片效果的得分等級(jí)分別為1、2.5、4和3，以2.0h固定時(shí)間的染色體滴片效果最好（圖1b3），評(píng)分等級(jí)最高。酶解時(shí)間分別為5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h時(shí)，其滴片效果的得分等級(jí)分別為3、4、5、2和1，以酶解時(shí)間為6.0h的染色體滴片效果最好（圖1c4），評(píng)分等級(jí)最高。滴片距離分別為10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0em時(shí)，其滴片效果的得分等級(jí)分別為1、3、5、4和2，以30.0cm距離的染色體滴片效果最好（圖1d3），評(píng)分等級(jí)最高。

2.2 二次回歸正交設(shè)計(jì)及回歸分析

據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，二次回歸正交組合設(shè)計(jì)零水平分別為2.0h、2.0h、6.0h和30.0cm。關(guān)鍵處理因子NO處理時(shí)間的上下水平分別為1.0h和3.0h，冰乙酸固定時(shí)間的上下水平分別為1.0h和3.0h，酶解時(shí)間的上下水平分別為5.0h和7.0h，滴片距離的上下水平分別為10.0cm和50.0cm。由m=4、m，=3，選用γ=1.547，設(shè)計(jì)4個(gè)因素：NO處理時(shí)間（Z）、冰乙酸固定時(shí)間（Z2）、酶解時(shí)間（Z3）和滴片距離（Z4），相應(yīng)編碼為x、x、x和x，列出因素水平編碼表（表3），將試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的編碼水平轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的實(shí)際水平，即得試驗(yàn)實(shí)施方案（表4）。

據(jù)四因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)表，整理數(shù)據(jù)后得到四因素二次回歸正交組合設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)矩陣及試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算表（表5），由此建立回歸方程：Y=6.18-0.25x+0.12x-0.29x+0.19x-0.30xx+0.10xx+0.06xx+0.29xx-0.03xx-0.13xx-1.47x’-1.41x'-1.45x'-1.20x'。

據(jù)表6顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，x、x、x和x，的二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平，其余各項(xiàng)回歸系數(shù)均不顯著，說明x、x、x和x的二次項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響，回歸關(guān)系極顯著，由此建立的數(shù)學(xué)模型與實(shí)際情況擬合較好。據(jù)平方項(xiàng)中心化公式：x’=x（x0）/n=x0.77，得到回歸方程：Y=10.44-0.25x+0.12x-0.29x+0.19x-0.30x₁x+0.10xx+0.06xx+0.29xx-0.03xx-0.13xx-1.47x-1.41x-1.45x-l.20x。以Y值最大為目標(biāo)函數(shù)，通過確定參數(shù)x（j=1，2，3，4）的最優(yōu)值。當(dāng)Y值最大時(shí)，據(jù)目標(biāo)函數(shù)解得x=-0.078，x=0.040，x=-0.110，x=0.360，將x=（Z-2）/0.65，x2=（Z2）/0.65，x=（Z-6）/0.65，x=（Z-30）/12.93代入得到實(shí)際因素Z=1.95，Z=2.04，Z=5.93，Z=34.65

綜上所述，根據(jù)回歸方程，優(yōu)選出各關(guān)鍵處理因子的最佳方案，基于試驗(yàn)操作的實(shí)際性，采用取整法，即得到本試驗(yàn)玉米染色體滴片法關(guān)鍵處理因子的最佳技術(shù)方案：NO處理時(shí)間2.0h，冰乙酸固定時(shí)間2.0h，酶解時(shí)間6.0h，滴片距離35.0cm。

3 討論

3.1 影響染色體滴片效果的主要因素

滴片法的操作步驟有取材、預(yù)處理、固定、解離和滴片。材料預(yù)處理的目的是改變細(xì)胞內(nèi)染色體形態(tài)及分散狀態(tài)，常采用秋水仙素、8-羥基喹啉和a-溴萘等藥劑進(jìn)行化學(xué)處理，本研究對(duì)材料的預(yù)處理則是通過增壓條件下的NO處理達(dá)到改良細(xì)胞內(nèi)染色體狀態(tài)的目的，同時(shí)避免了秋水仙素等化學(xué)試劑帶來的毒害和污染。材料固定的目的是使材料快速失活和蛋白質(zhì)沉淀，使材料保持初始狀態(tài)，卡諾氏I固定液和甲醇冰乙酸（1：3，體積比）混合液是常用的固定液，固定液固定時(shí)間是影響染色體壓片技術(shù)的因素之一，本試驗(yàn)選擇冰乙酸固定材料2h，取得了較好的效果。解離是植物染色體制片過程的重要環(huán)節(jié)，解離能分解細(xì)胞壁，消除細(xì)胞內(nèi)溶物，增加染色體清晰度，解離方法有酸解法和酶解法，酸解法往往因酸解過度造成染色體損傷，目前多采用酶解法，對(duì)于酶解時(shí)間，回歸分析選優(yōu)結(jié)果表明，采用2%纖維素酶和0.5%果膠酶混合液37C下酶解材料6.0h最適宜滴片法制片。不同于壓片法和火焰干燥法，滴片法的制片質(zhì)量取決于滴片技術(shù)，而滴片距離直接決定染色體制片的成敗，滴片距離過小，細(xì)胞內(nèi)染色體交叉重疊、分散性差，滴片距離過大則細(xì)胞內(nèi)染色體過度分散、細(xì)胞間染色體混雜，回歸分析選優(yōu)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞懸液以35.0cm的距離滴片可獲得分散性好、細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目完整的高質(zhì)量制片。滴片法常規(guī)試驗(yàn)中多采用20.0cm左右的滴片距離，35.0em的滴片距離在實(shí)際操作中可能存在滴片不準(zhǔn)、細(xì)胞懸浮液流向邊緣導(dǎo)致浪費(fèi)等問題。因此，在實(shí)際的試驗(yàn)操作中，需綜合考慮，或反復(fù)進(jìn)行滴片技術(shù)的訓(xùn)練，以達(dá)到最佳的制片效果。

3.2 植物染色體制片技術(shù)

染色體制片質(zhì)量是制約細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)展的重要因素，一張高質(zhì)量的染色體制片要求細(xì)胞有絲分裂中期相多、染色體分散無重疊及染色體完整性好。目前國內(nèi)外通常采用壓片法和低滲涂片法進(jìn)行染色體制片。染色體壓片技術(shù)作為常用的染色體制片方法，被廣泛應(yīng)用于各類生物，尤其是植物染色體研究。壓片法雖然操作簡單實(shí)用，但需要適宜的取材時(shí)間和嫻熟的壓片技術(shù)，對(duì)操作者的操作技術(shù)要求較高。染色體低滲涂片技術(shù)的核心是將試驗(yàn)材料均勻涂布在載玻片，上，從而有效降低壓片法所造成的染色體重疊。低滲涂片法盡管對(duì)操作技術(shù)要求不高，且制片效果較好，但其操作過程涉及火焰干燥和蓋玻片壓片，從而影響染色體完整性。染色體滴片法是將處理后的試驗(yàn)材料搗碎于冰醋酸溶液，然后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液利用自身重力滴落在玻片上，保證了細(xì)胞中染色體的分散性和完整性。滴片法是一種新的染色體制片方法，目前國內(nèi)尚未見有關(guān)滴片技術(shù)研究的相關(guān)報(bào)道，鑒于滴片法的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，它將廣泛應(yīng)用于染色體研究，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展。為規(guī)范染色體滴片技術(shù)，本研究基于前期的染色體滴片技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，通過設(shè)置染色體滴片技術(shù)關(guān)鍵處理因子，采用回歸分析模型，確立了最佳玉米染色體滴片技術(shù)方案。由此制作了高質(zhì)量的染色體制片，制片中細(xì)胞有絲分裂中期相多、細(xì)胞內(nèi)溶物和雜質(zhì)少、染色體著色均勻、染色體交叉重疊少、具有完整染色體組（2n=20）的細(xì)胞較多。

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